miR-424对非小细胞肺癌细胞株A549迁移及侵袭的影响

王 胜，熊 飞，开金丹

(湖北省肿瘤医院胸外科，武汉 430079)

研究报告

miR-424对非小细胞肺癌细胞株A549迁移及侵袭
的影响

王 胜，熊 飞，开金丹*

(湖北省肿瘤医院胸外科，武汉 430079)

目的探讨miR-424对非小细胞肺癌细胞株A549迁移及侵袭的影响。方法RT-PCR法检测肺癌细胞NCI-H460、NCI-H1975、NCI-H446、A549、NCI-H1299、NCI-H157及人胚肺成纤维细胞MRC-5中miR-424表达，脂质体LipofectamineTM2000将miR-424 inhibitor和miR-424 NC转入A549细胞中，48 h后，RT-PCR法检测miR-424表达，CCK-8法检测细胞活力，划痕实验检测细胞迁移能力，Transwell实验检测细胞侵袭能力，western blot检测基质金属蛋白酶2(MMP2)、MMP9、转化生长因子-β1(TGF-β1)及p-Smad3的表达。结果miR-424在肺癌细胞NCI-H460、NCI-H1975、NCI-H446、A549、NCI-H1299、NCI-H157中的[(1.78±0.13)，(1.69±0.10)，(1.89±0.18)，(2.88±0.27)，(2.52±0.20)，(2.49±0.23)]表达量显著高于miR-424在人胚肺成纤维细胞MRC-5中的(0.58±0.05)表达量(P< 0.01)。与miR-424 NC组比较，miR-424 inhibitor组miR-424表达量显著降低(P< 0.01)，细胞活力下降(P< 0.01)，细胞迁移及侵袭能力降低(P<0.01)，MMP2，MMP9，TGF-β1及p-Smad3表达量均显著下调(P< 0.01)。结论miR-424表达量下调后能通过抑制TGF-β1/Smad3信号通路进而抑制A549细胞的迁移及侵袭。

miR-424；非小细胞肺癌；A549；迁移；侵袭

肺癌是一种常见的呼吸道恶性肿瘤，在全世界范围内发病率及死亡率均居首位，且逐年成上升趋势。肺癌包括非小细胞肺癌及(non-small cell lung cancer,NSCLC)小细胞肺癌(SCLC)，前者占了将近85%的比例。近些年来虽然随着外科手术、化疗、放疗等医学技术手段不断提高，肺癌患者术后5年生存率仍不足5%，预后极差。造成这一结果的主要原因是肺癌的侵袭转移，因此探讨肺癌细胞的侵袭转移机制对于肺癌的治疗将具有重要意义[1-3]。miRNA是一种长度约为21～23 nt的高度保守的非编码小RNA分子，通过靶向调控靶基因mRNA表达，参与细胞的增殖、分化、凋亡、迁移及侵袭转移等生命过程[4, 5]。众多研究已经表明miRNA在包括肺癌在内的众多肿瘤组织中异常表达，miR-424是其中一种[5, 6]。miR-424是miR-16家族的一员，研究显示miR-424在不同的肿瘤组织中表达趋势不同，在NSCLC、乳腺癌、肾癌等组织中表达量上调，在宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌中表达量下调[7, 8]，但在肿瘤的发生过程中的具体作用机制尚未见报道，因此本研究将探讨miR-424在肺癌细胞株中的表达，及其对肺癌细胞迁移及侵袭的影响及相关机制。

1 材料和方法

1.1细胞株

人大细胞肺癌细胞NCI-H460，人肺腺癌细胞NCI-H1975，人小细胞肺癌细胞NCI-H446，人非小细胞肺癌细胞A549，H1299，NCI-157，人胚肺成纤维细胞MRC-5购于中国科学院上海细胞库。

1.2主要试剂和仪器

miR-424 inhibitor和miR-424 NC均购自广州锐博技术有限公司。兔抗人MMP2、MMP9、TGF-β1、Smad3和p-Smad3多克隆抗体均购自美国Abcam公司。胎牛血清和DMEM培养基均购自美国Hyclone公司。辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG (H+L)、BCA试剂盒和CCK-8试剂盒均购自南京凯基生物技术有限公司。Trizol法试剂盒、LipofectamineTM2000脂质体和一步法RT-PCR试剂盒均购自大连宝生生物技术有限公司。Transwell小室购自美国Corning公司。DYCZ-425D型双垂直电泳仪和DYCZ-40D型转印电泳仪均购自北京六一仪器厂。GelDoc XR System凝胶成像系统购自美国伯乐公司。FACSCalibur型流式细胞仪和168-1000XC型酶标仪均购自美国BD公司。AF6000型荧光显微镜购自德国莱卡公司。

1.3实验方法

1.3.1 RT-PCR法检测miR-424在细胞中的表达

使用Trizol试剂盒提取细胞总RNA，并检测纯度；接着采用一步法RT-PCR将RNA逆转录为cDNA并进行扩增；最后利用琼脂糖凝胶电泳检测cDNA扩增产物。miR-424上游引物：5’- CAGCAGC AAUUCAUGUUUUGAA -3’，下游引物：5’-CGCTTC ACGAATTTGCGTGTCAT-3’； GAPDH上游引物：5’-AGCCACATCGCTCAGACA-3’，下游引物：5’-TGGA CTCCACGACGTACT-3’。 上游引物和下游引物由上海生工合成。

1.3.2 细胞转染

当A549细胞生长至50%左右时，利用LipofectamineTM2000脂质体将miR-424 inhibitor和miR-424 NC转染到A549细胞中，6 h后弃去培养液，换成含10%血清的DMEM培养基并继续培养48 h。使用RT-PCR法检测细胞中miR-424表达。

1.3.3 CCK-8法检测A549细胞活力

将5×103个A549细胞接种至96孔板，培养24 h，按“1.3.2”进行转染，48 h时每孔中均加入CCK-8试剂，继续孵育4 h，然后利用酶标仪检测波长570 nm处的OD值，所测OD值即为细胞活力。

1.3.4 划痕实验检测细胞迁移能力

取按“1.3.2”进行转染的A549细胞接种到6孔板，继续培养24 h后，用200 μL的枪头对6孔板内的细胞进行划痕，接着用PBS洗去脱落下来的细胞，继续培养24 h，于倒置显微镜下进行拍照并每孔选取4个视野进行划痕距离的记录。

1.3.5 Transwell法检测细胞侵袭能力

实验前将Matrigel胶均匀的平铺于Transwell小室微膜上，备用。将1×104个A549细胞接种于6孔板后，按“1.3.2”进行转染，继续培养48 h后，用胰蛋白酶将细胞消化下来并制成单悬液，用含有10%胎牛血清的DMEM培养基重悬，并接种至Transwell上室，下室仅加入含10%胎牛血清的DMEM培养基，48 h后，将Transwell小室取出，用多聚甲醛固定细胞，接着结晶紫染色，并在倒置显微镜下进行观察，对Transwell下室5个视野中的细胞计数取平均值，即为细胞的侵袭数目。

1.3.6 Western blot检测细胞MMP2、MMP9、TGF-β1、Smad3、p-Smad3中表达

将1×105个细胞接种至6孔板，按“1.3.2”操作步骤进行转染，培养48 h，在冰浴条件下将6孔板中的细胞刮取并离心收集，向其中加入细胞裂解液，30 min后离心收取上清液即为总蛋白，总蛋白浓度测定及定量根据BCA试剂盒说明书进行，接着将蛋白煮沸变性，取大约30 ng左右蛋白样品上样，进行十二烷基苯磺酸钠凝胶电泳2 h；接着湿法转膜30～50 min。2%BSA室温下孵育1 h，一抗溶液(兔MMP2，MMP9，TGF-β1，Smad3，p-Smad3多克隆抗体，稀释度为1∶100) 4℃过夜孵育。第二天在室温条件下，在二抗溶液(辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG (H+L))中孵育1～2 h，凝胶成像系统中曝光。

1.4统计学方法

2 结果

2.1miR-424在肺癌细胞及胚肺成纤维细胞中的表达

如图1所示，miR-424在肺癌细胞NCI-H460、NCI-H1975、NCI-H446、A549、NCI-H1299、NCI-H157中[(1.78±0.13)、(1.69±0.10)、(1.89±0.18)、(2.88±0.27)、(2.52±0.20)、(2.49±0.23)]的表达量显著高于miR-424在人胚肺成纤维细胞MRC-5(0.58±0.05)中的表达量，差异有显著性(P< 0.01)。

注：1：MRC-5；2：NCI-H460；3：NCI-H1975；4：NCI-H446；5：A549；6：NCI-H1299；7：NCI-H157；与MRC-5比较，** P< 0.01；miR-214表达量即是miR-214的拷贝数。图1 miR-424在肺癌细胞及胚肺成纤维细胞中的表达Note.1：MRC-5 cells；2：NCI-H460 cells；3：NCI-H1975 cells；4：NCI-H446 cells；5：A549 cells；6：NCI-H1299 cells；7：NCI-H157 cells；Compared with MRC-5, ** P< 0.01；The expression of miR-214 is miR-214 copy number.Fig.1 Expression of miR-424 in the lung cancer cells and embryonic lung fibroblasts

注：与miR-424 NC比较，** P< 0.01。图2 miR-424 inhibitor转染效果的检测Note.Compared with the miR-424 NC, ** P< 0.01.Fig.2 Detection of transfection efficiency of miR-424 inhibitor

2.2miR-424inhibitor转染效果的检测

如图2所示，与miR-424 NC组(2.89±0.28)比较，miR-424 inhibitor组(0.74±0.07)中miR-424表达量下降 (P< 0.01)。

2.3miR-424inhibitor对A549细胞活力的影响

与miR-424 NC组(0.72±0.07)比较，miR-424 inhibitor组(0.35±0.03)细胞活力均降低 (P< 0.01)。

2.4miR-424inhibitor对A549细胞迁移及侵袭能力的影响

如图3所示，与miR-424 NC组(25.34±2.35)比较，miR-424 inhibitor组(4.78±0.45)细胞迁移距离降低(P< 0.01)。如图4所示，与miR-424 NC组(156.49±14.55)比较，miR-424 inhibitor组(39.76±3.28)细胞侵袭数目降低(P< 0.01)。

图3 miR-424 inhibitor对A549细胞迁移能力的影响( ×200)Fig.3 Effect of miR-424 inhibitor on A549 cell migration ability

图4 miR-424 inhibitor对A549细胞侵袭能力的影响( ×200)Fig.4 Effect of miR-424 inhibitor on A549 cell invasion ability

2.5miR-424inhibitor对A549细胞中MMPs表达量的影响

如图5所示，与miR-424 NC组比较，miR-424 inhibitor组中MMP2、MMP9表达量显著下调，差异有显著性(P< 0.01)。

图5 miR-424 inhibitor对A549细胞中MMPs表达量的影响Fig.5 Effect of miR-424 inhibitor on the expression of MMPs in A549 cells

2.6miR-424inhibitor对A549细胞中TGF-β信号通路的影响

如图6所示，与miR-424 NC组比较，miR-424 inhibitor组中TGF-β1、p-Smad3表达量显著下调，差异有显著性(P< 0.01)。

图6 miR-424 inhibitor对A549细胞中TGF-β信号通路的影响Fig.6 Effect of miR-424 inhibitor on TGF-β signal pathway in A549 cells

3 讨论

相关学者于1993年在秀丽隐杆线虫中首次发现了miRNA的存在，即lin-4；于2000年在秀丽隐杆线虫中又发现了第二个miRNA，即let-7。后续的十几年来在脊椎动物、植物及病毒中发现了近千种的miRNA，并发现了miRNA不仅与生长发育，免疫调控有关，还发现miRNA所定位的基因组处于肿瘤相关的脆性区，提示了miRNA与肿瘤的发生可能密切相关[4, 5]。相关学者于2002年证实了miRNA和肿瘤的关系，慢性淋巴细胞白血病患者中miR-15和miR-16表达量下调，并且这两个miRNA与白血病的发生发展密切相关，引发了探讨miRNA在肿瘤发生过程中的作用的相关研究[5, 6]。miR-15/16家族包括了miR-15a/b，miR-16，miR-195，miR-424和miR-497。其中miR-424定位于人类染色体Xq26.3上，但在鼠类中的同源物为miR-322。研究显示miR-424在不同的生理和病理条件下其作用效果不一样。如miR-424在NSCLC、乳腺癌、肾癌等组织中表达量上调，在宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌中表达量下调，但具体的作用机制尚未见报道[7, 8]。因此本研究将探讨miR-424在肺癌中的作用机制。首先Chen等[9]研究发现miR-424在肺癌患者病灶组织及肺癌细胞系中的表达量均显著提高。Donnem等[10]研究发现生存时间短的NSCLC患者中miR-424表达量显著的高于生存时间长的NSCLC患者，且这一过程可能与miR-424促血管生成有关。所以本研究首先利用RT-PCR法检测肺癌细胞NCI-H460，NCI-H1975，NCI-H446，A549，NCI-H1299，NCI-H157及人胚肺成纤维细胞MRC-5中miR-424的表达量，结果与Chen等[9]，Donnem等[10]研究一致，肺癌细胞中miR-424的表达量显著高于MRC-5细胞中的表达量，提示miR-424在肺癌的发生发展中起促进作用。同时miR-424在A549中的表达量最高，所以本研究选取此细胞株作为后续研究对象。接着利用脂质体转染miR-424 inhibitor和miR-424 NC，RT-PCR法证明转染成功。进一步CCK-8法检测miR-424 inhibitor对A549细胞活力的影响，结果表明miR-424 inhibitor能显著的降低A549活力，与miR-424在胃癌细胞中的作用一致[11]。

研究已经显示肺癌细胞的侵袭转移是导致肺癌患者预后不良，5年生存率低的主要原因[1-3]。因此本研究进一步的探讨miR-424 inhibitor对A549细胞迁移及侵袭能力的影响，结果表明miR-424 inhibitor能显著的抑制A549的迁移及侵袭能力。weel，Chk1，CYLD，Wnt3a，BCL-2，E2F6蛋白是目前已报道的miR-424的靶基因，但上述蛋白主要与细胞增殖、凋亡、细胞周期有关的，而与细胞的迁移及侵袭关系不大[7, 8]。另外细胞外基质的降解是细胞迁移，侵袭及转移等过程中的必经过程，MMPs是降解细胞外基质最为主要的蛋白水解酶。同时MMPs也是一组Zn2+-Ca2+依赖性蛋白酶，可以降解几乎所有的ECM成分。其中MMP2可以通过降解细胞外基质成分和诱导血管新生进而促进肿瘤细胞浸润[12]。MMP9是MMPs中分子量最大的蛋白水解酶，几乎也能降解所有的细胞外基质成分，提高肿瘤细胞的运动能力[13]。所以本研究进一步的探讨miR-424 inhibitor对A549细胞迁移及侵袭的影响，结果表明miR-424 inhibitor能显著的下调MMP2及MMP9表达量，提示miR-155 inhibitor能通过下调MMPs进而抑制A549细胞的迁移及转移。

肿瘤细胞的迁移、侵袭等生物学过程受多种信号通路调控，TGF-β就是其中一种[14, 15]。TGF-β包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3，其中TGF-β1研究最为广泛。而TGF-β1/Smad信号通路也是TGF-β1介导的最为主要的信号通路，TGF-β1与其下游受体Smad2/3结合后，将信号传递到细胞核，进而调控靶基因的转录。且有研究表明miR-424能通过抑制TGF-β1/Smad3信号通路进而抑制胃癌细胞的增殖，迁移等生物学行为[11]，提示miR-424可能也可以通过调控TGF-β1/Smad3信号通路进而抑制A549细胞的迁移及侵袭。所以本研究继续探讨miR-424 inhibitor对A549细胞中TGF-β1/Smad3信号通路的影响，结果表明miR-424 inhibitor能显著的下调TGF-β1、p-Smad3表达，进而抑制A549细胞的迁移及侵袭。

综上所述，miR-424在肺癌细胞中的表达量高于人胚肺成纤维细胞中的表达量，miR-424 inhibitor能显著的抑制A549细胞的迁移及侵袭，并下调MMP2及MMP9表达，与抑制TGF-β1/Smad3信号通路有关。

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EffectofmiR-424onmigrationandinvasionofnon-smallcelllungcancercellsA549

WANG Sheng， XIONG Fei， KAI Jin-dan*

(Department of Thoracic Surgery, Hubei Cancer Hospital, Wuhan 430079，China)

ObejectivesTo explore the effect of miR-424 on migration and invasion of non-small cell lung cancer A549 cells.MethodsExpression of miR-424 in NCI-H460, NCI-H1975, NCI-H446, A549, NCI-H1299, NCI-H157 lung cancer cells and embryonic lung fibroblasts MRC-5 cells was examined by RT-PCR.miR-424 inhibitor and miR-424 NC were transfected into A549 cells with liposome LipofectamineTM2000. Cell viability was measured by MTT assay. Cell migration and invasion was measured by wound scratch assay and transwell migration assay,respectively.The expression of matrix metalloproteinase 2 (MMP2), MMP9, transforming growth factor-β (TGF-β1), p-Smad3 was measured by western blot.ResultsThe expression of miR-424 in NCI-H460, NCI-H1975, NCI-H446, A549, NCI-H1299, NCI-H157 cells (1.78±0.13, 1.69±0.10, 1.89±0.18, 2.88±0.27, 2.52±0.20, 2.49±0.23) was significantly higher than that in MRC-5 cell 0.58±0.05(P< 0.01). Compared with the miR-424 NC group, the cell viability was reduced (P<0.01), cell migration and invasion ability was decreased (P< 0.01), and the expression of MMP2, MMP9, TGF-β1, p-Smad3 protein was down-regulated in miR-424 inhibitor group (P< 0.01).ConclusionsmiR-424 inhibitor can inhibit the migration and invasion in lung cancer A549 cells via inhibition of TGF-β1/Smad3 signal pathway.

miR-424; Non-small cell lung cancer; A549; Migration; Invasion

R-33

A

1671-7856(2017) 10-0074-06

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.10.015

2017-02-14

王胜(1980-)，男，硕士生，主治医师，研究方向：胸部肿瘤的外科及综合治疗。E-mail: 13643651@qq.com

开金丹，E-mail: glucosecn@hotmail.com