姜黄素对癫痫幼鼠学习记忆及神经元凋亡的影响*

廖 婕 梅 燕

（1.四川省成都市温江区妇幼保健院，四川 成都611130；2.重庆市中医院，重庆400021）

·实验报告·

姜黄素对癫痫幼鼠学习记忆及神经元凋亡的影响*

廖 婕1梅 燕2△

（1.四川省成都市温江区妇幼保健院，四川 成都611130；2.重庆市中医院，重庆400021）

目的观察姜黄素对癫痫幼鼠的学习记忆及海马组织神经元凋亡的影响并探讨其机制。方法将50只21 d龄的SD幼鼠随机分正常组，模型组，姜黄素高（100mg/kg）、姜黄素中（50mg/kg）、姜黄素低（25mg/kg）剂量组，姜黄素各组给予相应剂量姜黄素灌胃，连续2周。Morris水迷宫法检测乳鼠学习记忆能力、TUNEL法检测乳鼠海马神经元的凋亡、Western blotting法检测Cleaved-caspase-3蛋白的表达情况。结果与模型组大鼠比较，姜黄素高、中、低剂量组的学习记忆能力显著提高（P＜0.01）；细胞凋亡情况显著改善（P＜0.01）；且Cleaved-caspase-3蛋白的表达显著降低（P＜0.01）。结论姜黄素可能通过抑制Cleaved-caspase-3蛋白的表达，从而抑制癫痫幼鼠海马神经元的凋亡。

姜黄素 癫痫 神经元 凋亡

癫痫是一种以大脑神经元过度放电而引起的暂时性脑功能失常为特征的疾病[1]。癫痫发作可以引起神经元的损伤，引发神经元的凋亡[2]。姜黄素（curcumin）是姜科植物姜黄的主要有效成分，是一种小子分多酚类化合物[3]。现代药理研究证实，姜黄素具有抗氧化、抗凋亡和抗炎的作用，且对由脑缺血再灌注损伤引起的神经元凋亡有保护作用[4]。本实验利用戊四氮干预大鼠乳鼠构建癫痫幼鼠模型，探讨姜黄素对癫痫幼鼠神经元的保护作用。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物50只21 d龄的SD大鼠幼鼠，体质量（40±2）g，购自重庆市中医院中药研究院，随机分为正常组，模型组，姜黄素高、中、低剂量组，每组10只。

1.2 试药与仪器 姜黄素 （纯度≥99%）购自美国Sigma公司，溶于0.9%氯化钠溶液中，配成25 mg/mL的浓度剂量；戊四氮 （PTZ），购自美国Sigma公司；TUNEL试剂盒购自南京建成生物工程研究所；全蛋白提取试剂盒、Cleaved-caspase-3小鼠抗单克隆抗体，购自美国Cell Signalling Technology公司；β-actin小鼠单克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.3 造模与分组 癫痫模型的建立，除正常组以外，其余各组幼鼠每日以40mg/kg的剂量腹腔注射PTZ。正常组每日注射相应容积的0.9%氯化钠溶液，连续21 d。每日观察各组幼鼠在给予PTZ后的癫痫发作情况，时间为1 h。根据Racine分级法对癫痫程度分级[5]，见表1，造模成功的大鼠达到Ⅳ～Ⅴ级惊厥标准。如1 h后无Ⅳ级以上癫痫发作，再次腹腔注射20mg/kg的PTZ，直到癫痫发作。动物的给药，待癫痫模型建立好后第1日起，姜黄素高、中、低剂量组大鼠每日灌胃100mg/kg、50mg/kg和25mg/kg的姜黄素，对照组和模型组灌胃相应容积的0.9%氯化钠溶液，连续2周。

表1 Racine癫痫程度分级法

1.4 标本采集与检测1）Morris水迷宫实验。给药完毕后，连续4 d进行定位航行实验，每日上午和下午定点训练1次，测量大鼠游到平台的时间（逃避潜伏期）。第5日撤除平台，记录120 s内大鼠穿越原平台所在象限的搜索时间、原平台象限游泳距离占总距离的百分比、穿越平台次数。2）TUNEL法检测细胞凋亡情况。待动物行为学实验后，处死动物，断头取脑，用4%的多聚甲醛磷酸缓冲液固定，石蜡包埋，切片，染色。严格按照TUNEL试剂盒的操作步骤进行操作。3）Cleaved-caspase-3蛋白表达检测。采用Western blotting方法，严格按照全蛋白提取试剂盒的操作步骤提取海马组织全蛋白。蛋白由SDS-PAGE凝胶进行分离，待PVDF膜转膜后，再用5%的脱脂牛奶进行1 h的封闭。分别加入鼠抗Cleaved-caspase-3、p-Cleavedcaspase-3多克隆抗体（1∶250），在4℃下孵育过夜，经TBST洗涤3次，各10min，再加入HRP标记的山羊抗兔的二抗（1∶500），摇床上孵育2 h，TBST洗涤3次，每次10 min，Bio-RAD图像分析仪进行图像扫描，Quantity One软件进行灰度值测定，以Cleaved-caspase-3与β-actin的灰度值之比表示Cleaved-caspase-3蛋白的相对表达量。

1.5 统计学处理 应用SPSS22.0统计软件。计量资料以（±s）表示，组间比较用t检验进行分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组Morris水迷宫实验结果比较 见表2。训练第4日，与正常组相比，模型组和姜黄素高、姜黄素中、姜黄素低剂量组逃避潜伏期显著延长（P＜0.05）；与模型组相比，姜黄素高、姜黄素中、姜黄素低剂量组逃避潜伏期显著缩短（P＜0.05或P＜0.01）。与正常组相比，模型组和姜黄素高、姜黄素中、姜黄素低剂量组在四象限的游泳时间显著缩短（P＜0.05），游泳距离与总距离之百分比及穿越平台次数显著降低 （P＜0.05或P＜0.01）；与模型组相比，姜黄素高、姜黄素中、姜黄素低剂量组在四象限的游泳时间显著延长（P＜0.05），游泳距离与总距离之百分比及穿越平台次数显著增加（P＜0.05或P＜0.01）。

表2 各组癫痫幼鼠Morris水迷宫检测结果比较（±s）

表2 各组癫痫幼鼠Morris水迷宫检测结果比较（±s）

与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

组 别n正常组10模型组10姜黄素高剂量组10逃避潜伏期（s）原平台象限游泳时间（s）游泳距离与总距离百分比（%）穿越次数（次）7.21±2.15△△8.56±2.74△△47.80±3.86△△9.82±2.09△△19.88±4.08**4.01±2.16**26.34±3.22**4.04±1.77**13.16±3.43**△△7.07±2.30**△△37.92±4.98**△△7.24±1.90**△△姜黄素中剂量组10 14.74±3.97**6.99±2.35*36.84±4.67**7.01±1.8**△△姜黄素低剂量组10 15.04±3.50*△△6.46±2.03*△△35.77±4.40**△△6.83±2.03*△△

2.2 各组TUNEL检测结果比较 见表3。与正常组相比，模型组及姜黄素高、中、低剂量组幼鼠大脑海马区有大量TUNEL阳性凋亡神经元细胞（P＜0.01）；与模型组相比，姜黄素高、姜黄素中、姜黄素低剂量组幼鼠海马区有较少的TUNEL阳性凋亡神经元（P＜0.01）。

表3 各组癫痫幼鼠海马区TUNEL阳性细胞计数比较（个，±s）

表3 各组癫痫幼鼠海马区TUNEL阳性细胞计数比较（个，±s）

组 别n正常组10模型组10姜黄素高剂量组10阳性细胞数7.70±1.14△△198.66±31.30**115.48±20.26**△△姜黄素中剂量组10 110.88±21.43**△△姜黄素低剂量组10 106.29±19.45**△△

2.3 各组Cleaved-caspase-3蛋白的表达水平比较

见图1和表4。与正常组相比，模型组及姜黄素高、中、低剂量组幼鼠大脑海马组织Cleaved-caspase-3蛋白的表达显著升高（P＜0.01）；与模型组相比，姜黄素高、中、低剂量组幼鼠海马区Cleaved-caspase-3蛋白的表达显著降低（P＜0.01）。

图1 Cleaved-caspase-3蛋白表达的Western blotting图

表4 各组癫痫幼鼠海马组织Cleaved-caspase-3蛋白表达水平比较（±s）

表4 各组癫痫幼鼠海马组织Cleaved-caspase-3蛋白表达水平比较（±s）

组 别n正常组10模型组10姜黄素高剂量组10 Cleaved-caspase-3 0.08±0.07△△1.78±0.24**0.98±0.16**△△姜黄素中剂量组10 1.05±0.13**△△姜黄素低剂量组10 1.17±0.20**△△

3 讨 论

癫痫发作时可引起神经元损伤，导致神经细胞凋亡及坏死[6]。 惊厥发作的时候，海马区会发生缺血缺氧，从而引起海马神经受损、凋亡，且癫痫发作时间越长，频率越高，海马神经元损伤的程度更重[7]。姜黄素来源于姜科植物根茎，是一种植物多酚，具有多种药理活性，如抗氧化、抗癌、抗炎症等[8]。近年来研究发现，姜黄素能显著改善阿尔茨海默症、帕金森等疾病，其机制与其抗氧化、抗炎、抗凋亡相关[9]。

Caspase是半胱氨酸蛋白酶家族的重要一员，在细胞凋亡中起着关键的调控作用[10]。Caspase家族核心成员为Caspase-3，其为半胱氨酸蛋白酶，能被天冬酰胺特异酶切[11]。Caspase-3在细胞凋亡早期，是被激活的重要蛋白酶，也叫做死亡蛋白酶，是凋亡的最后执行因子[12]。Caspase-3通常是以无活性的Pro-Caspase（Caspase-3前体）形式而存在[13]，当细胞受外界凋亡信号激活时，Caspase-3被剪切后产生Cleaved Caspase-3的活性片段[14]，其表达可直接反应细胞的凋亡情况[15]。

通过本实验研究发现，姜黄素对癫痫幼鼠的学习记忆能力有显著提高，能减轻海马区神经元凋亡的情况，并显著降低Cleaved-caspase-3蛋白的表达，说明姜黄素对癫痫幼鼠的神经元具有保护作用，其具体机制值得进一步深入探讨。

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Effects of Curcum in on Learning and Memory and Neuron Apoptosis in Epileptic Immature Rats

LIAO Jie，MEI Yan.Maternal and Child Health Care Hospital of Wenjiang District of Chengdu，Sichuan，Chengdu 611130，China.

Objective：To explore the effects of curcumin on learning and memory and neuron apoptosis in epileptic immature rats.MethodsA total of 50male SD rats around 21 days of age were randomly allocated into 5 groups：the normal saline group，pentylenetetrazole（PTZ）group，high-dose curcumin group（100 mg/kg），middle-dose curcumin group（50 mg/kg），and low-dose curcumin group（25 mg/kg）.Curcumin was administrated orally for 2w.Morris water maze method was used to detect the learning and memory ability of neonatal rats；TUNEL method was used to detect the apoptosis of hippocampal neurons and the expression of cleaved-caspase-3 protein was detected by Western blottingmethod.ResultsCompared with in the model group，the high，medium and low dose groups significantly improve the ability of learning and memory（P＜0.01）；cell apoptosis was significantly improved（P＜0.01）；the expression of cleaved-caspase-3 protein was significantly decreased（P＜0.01）.ConclusionCurcumin can inhibit the expression of cleaved-caspase-3 protein and inhibit the apoptosis of hippocampal neurons in epileptic rats.

Curcumin；Epilepsy；Neuron；Apoptosis

R285.5

A

1004-745X（2017）10-1763-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.10.024

重庆市基本科研业务费资助项目（CSTC-jbky-01717）

△通信作者（电子邮箱：2735666720@qq.com）

2017-04-12）