基于R语言的益气活血方药中丹酚酸B提取工艺研究*

石功德 周 静 李 敏 虞 立 金伟锋 李晓红 张宇燕（浙江中医药大学，浙江 杭州310053）

基于R语言的益气活血方药中丹酚酸B提取工艺研究*

石功德 周 静 李 敏 虞 立 金伟锋 李晓红 张宇燕△（浙江中医药大学，浙江 杭州310053）

目的应用正交试验法、R语言结合BP神经网络和遗传算法优化益气活血方药组方丹参中水溶性成分丹酚酸B的提取工艺。方法以丹酚酸B的提取率为指标，采用正交试验设计方法进行提取考察。应用R语言结合BP神经网络及遗传算法对正交试验数据进行目标寻优，从而得到最佳提取工艺条件。结果丹酚酸B的最佳提取工艺条件为12倍体积的水，煎煮3次，每次1 h，提取液加乙醇使醇沉浓度达70%。网络预测值为110.52mg/g，验证试验平均值为116.174 mg/g，相对误差为4.87%，具有良好的网络预测性。结论本实验建立的丹酚酸B提取工艺的数学模型可用于丹酚酸B提取工艺的分析和预测，同时为实现中药有效成分的目标寻优提供新的参考。

R语言 丹酚酸B正交设计 神经网络 提取工艺

益气活血方药是由黄芪、丹参、川芎等中药组成，临床用于治疗缺血性中风已取得较好的疗效，其主要组成药物丹参为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根及根茎，具有祛瘀止痛、活血通经、清心除烦的功效[1]。现代医学认为，丹参具有扩张冠状动脉，增加冠状动脉血流量，防止心肌缺血和心肌梗死，加快微循环血流，促进毛细血管网开放，抑制心肌收缩，减少能量消耗，扩张血管，降低胆固醇、血脂，抑制凝血，激活纤溶，稳定红细胞膜，提高缺氧耐受力，增加肝脏血流量，保护肝损伤细胞，抗肝纤维化，抑制中枢神经系统以及消炎抗菌等作用[2-5]。其脂溶性成分具有抗菌、抗炎、抗氧化等药理作用[6-7]。

丹参水溶性的酚酸成分主要有丹酚酸B，是研究较多的丹酚酸之一。丹酚酸B具有很强的抗氧化作用[8-10]，体内外实验证明，丹酚酸B能清除氧自由基、抑制脂质过氧化反应，其作用强度高于维生素C、维生素E、甘露醇，是目前已知的抗氧化作用最强的天然产物之一。药理学研究表明，注射用丹参酚酸具有明显的抗氧化、抑制血小板聚集及抑制血栓形成的作用，并能延长缺氧条件下动物的存活时间[11]。本实验采用正交设计方法考察丹酚酸B的提取工艺，进而运用R语言并结合BP神经网络和遗传算法对正交试验所得数据进行分析处理，最后优化得到丹酚酸B的最佳提取工艺，可为益气活血方药中药新药开发奠定基础，也为含有丹参类药材及丹酚酸B的中药制剂工艺研究提供参考。现报告如下。

1 试药与仪器

密封式恒温可调式电加热器（FD-2型，嘉兴市欣欣仪器设备有限公司）；低速离心机（SC-3610型，安徽中科中佳科学仪器有限公司）；电子天平（XS205型，梅特勒-托利多仪器有限公司）；紫外可见分光光度计（UV-2800/2802/2802S，上海恒科仪器有限公司）。丹参：购自浙江中医药大学中药饮片有限公司，经检验为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根及根茎。经检验符合2015年版《中国药典（一部）》丹参项下有关规定。丹酚酸B（批号：PA0418RA，上海源叶生物科技有限公司）；甲醇，分析纯，衢州巨氏试剂有限公司。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备 精密称取丹酚酸B对照品2.44mg，置25mL容量瓶中，加75%甲醇溶解并稀释至刻度，制成97.6μg/mL的丹酚酸B对照品溶液。

2.2 供试品溶液的制备 将丹酚酸B提取浓缩液转移至50mL容量瓶中，用75%甲醇定容，摇匀。精密移取0.5 mL溶液至25 mL容量瓶中，75%甲醇定容，即为供试品溶液。

2.3 标准曲线的制备 精密吸取对照品溶液0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5mL， 分别置10mL容量瓶中，加75%甲醇稀释至刻度，摇匀；286 nm处测定吸光度，以吸光度对质量浓度进行线性回归，得回归方程y=56.276X-0.2240，R=0.9997，线性范围4.88～43.92μg/mL。

2.4 精密度试验 取丹酚酸B对照品，按上述含量测定方法检测5次，测得吸收度。计算丹酚酸B吸收度的相对标准偏差RSD=0.34%，表明精密度良好。

2.5 稳定性试验 称取丹酚酸B对照品，按上述含量测定法在0、2、4、6、8 h后检测吸收度。计算丹酚酸B吸光度的相对标准偏差RSD为0.25%。

2.6 重复性试验 称取同一批样品5份，按上述含量测定法进行测定，检测丹酚酸B含量，计算丹酚酸B含量相对标准偏差RSD=1.35%，

2.7 加样回收试验 精密称取6份已知含量的丹参粉末各0.3 g，按1∶1比例精密加入丹酚酸B对照品，按照供试品溶液制备方法制备样品液，依次显色后测定吸收度，计算加样回收率为101.5%，RSD=1.34%。

2.8 丹参正交实验及工艺优化 称取丹参药材3 g，按照L9（34）正交试验表进行实验，以提取物中丹酚酸B含量为指标，考察影响水煎提取丹参的4个主要因素：加水量（A）、煎煮时间（B）、煎煮次数（C）、醇沉浓度（D）（见表1），实验结果见表2。

表1 因素水平表

表2 正交试验结果

2.9 R语言环境下BP神经网络建模 本实验在R语言下建立3层结构（只有1个隐层）的BP神经网络模型，输入层节点数设置为4，分别是加水量、煎煮时间、煎煮次数及醇沉浓度，输出节点数为1，即丹酚酸B的提取率。将正交试验9组实验数据分别采用留一法进行交叉验证，相关参数分别设置为初始随机权（rang）0.1，参数重量衰变（decay）5×10-5，最大迭代次数（maxit）500，其他参数设置为默认值。在此参数条件下对BP神经网络进行留一法交叉训练，以平均拟合误差和平均预测误差作为选取隐层神经元（size）的依据，结果如表3。由表3可知，隐层神经元（size）为1时，平均拟合误差、平均预测误差均小于5%，具有统计学意义，而隐层神经元为0、2、3时，不符合筛选条件。同时，隐层神经元数增加到一定数目时，可能会产生过度拟合现象[4]。继而在上述参数条件下，以正交试验的9组数据为样本，对不同个数的隐层神经元（size）进行拟合误差的训练，结果见表4。随着隐层神经元（size）个数的增加，拟合误差呈先增大再降低的趋势，由此可判断为隐层神经元 （size）1之后增加神经元数将导致网络模型拟合过度。因此，此次模型的隐层神经元（size）设定为1，此时BP神经网络稳定可靠。

2.10 R语言环境中应用遗传算法进行目标优化 遗传算法是一种基于自然界优胜劣汰的进化规律和基因遗传学原理的优化搜索方法。在“优胜劣汰、适者生存”的生物进化论基础上，遗传算法将初始群体的全部个体进行编码，按照一定的适配值函数及复制、交叉、突变等一系列遗传操作对各个个体进行筛选，淘汰适应度低的解，适应度高的个体组成新的种群，重复此过程，直至满足一定的极限条件。因此，遗传算法可实现全局优化搜索，且搜索能力较强，可避免繁琐的数学公式推导和参数选择。

表3 隐层神经元（size）训练结果（%）

表4 隐层神经元（size）测试训练结果

根据遗传算法的基本思想，采用实数编码方式，种群大小为1000，接近的最大代数为100，最大不可变代数为10，收敛公差为1×10-4，其他参数均设为默认值。运用R语言代码进行编程，由遗传算法得到的结果运行时间为1 s，运行到第12代时找到丹酚酸B的最佳提取条件为12倍体积的水，煎煮3次，每次1 h，提取液加乙醇使醇沉浓度达70%，此条件下得到的最优提取率为110.52mg/g。

3 最佳工艺验证

称取15 g丹参5份，按照上述优化后的条件，即12倍体积的水，煎煮3次，每次1 h，提取液加乙醇使醇沉浓度达70%，进行提取，按“标准曲线的制备”方法测定丹酚酸B的含量。结果见表5，丹酚酸B的平均提取含量116.174mg/g。实验测量值和网络预测值的相对误差为4.87%，小于5%，说明优化后实验测量和网络预测较吻合，该数学模型稳定性良好，具有较好的网络预测性。

4 讨 论

R语言是一种免费的为统计计算和图形展现而设计的编程语言和统计环境，具有强大的数学统计分析和科学数据可视化功能，既可以提供各种数据处理、统计分析及图形显示工具，可通过编制相应函数扩展现有的R语言的功能[12-13]，操作简便，功能较为强大。但国内医药领域对R语言较陌生，且相应出版物较少。在R环境中应用BP神经网络和遗传算法对正交实验数据进行目标寻优及分析预测更是屈指可数[14-15]。

表5 最佳工艺验证结果（mg/g）

BP神经网络是通过反向传播不断地调整网络权值和阈值的应用最广泛的神经网络模型之一[16-17]，为较好地处理复杂的非线性问题提供了选择。它的学习规则是使用最速下降法，训练算法简单明确、计算量小、并行性强，对于多维非线性系统参数优化提供了选择。正交设计仅仅考虑了几个试验点各因素对提取工艺的影响，未从整个试验区间进行考虑，因此优选出的参数往往是较优而非最优[9]。本次试验将传统的正交试验数据与BP神经网络相结合将离散数据变为连续数据，通过网络的仿真功能对试验影响因素的变化进行仿真分析，模拟延伸正交试验设计以外的实验过程，反映各因素的变化规律，从而获得多因素连续区域中的最优提取组合。

本实验采用正交设计对丹参中水溶性成分丹酚酸B提取工艺进行考察，进而运用R语言并结合BP神经网络和遗传算法对正交试验所得数据进行分析处理，最后优化得到丹酚酸B的最佳提取工艺（12倍体积的水，煎煮3次，每次1 h，提取液加乙醇使醇沉浓度达70%），可为益气活血方药中药新药开发奠定基础，也为含有丹参类药材及丹酚酸B的中药制剂工艺研究提供参考。

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Optimization Extraction Technique of Salvianolic Acid B in Yiqi Huoxue Decoction Based on R Language

SHI Gongde，ZHOU Jin，LIMin，et al.Zhejiang University of Chinese Medicine，Zhejiang，Hangzhou 310053，China.

Objective：To optimize the extraction technology of salvianolic acid B in Yiqi Huoxue Decoction with orthogonal experiment，R language，BP neural network and genetic algorithm.Methods：Taking the extraction rate of salvianolic acid B as the index，the orthogonal experimental design method was used to extract and investigate.R language，BP neural network and genetic algorithm were used to optimize the orthogonal experimental data，so as to obtain the optimum extraction process conditions.ResultsThe optimization of extraction technology was as follows：12 times of the volume of water were boiled for 3 times，each time for 1h，and the alcohol concentration reached 70%.The network predictive value was 110.52 mg/g；the experimental average value was 116.174 mg/g，and the relative error was 4.87%.So it had a good network prediction.ConclusionThis mathematical model can be used to analyze and predict the extraction technology of salvianolic acid B in Yiqi Huoxue Decoction，providing a new reference for screening optimization of Chinese medicine components.

R language；Salvianolic acid B；Orthogonal design；Neural network；Extraction

R289.5

A

1004-745X（2017）10-1700-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.10.003

浙江省自然科学基金项目（LR16H270001）；浙江省中医药科技计划项目（2017ZB024）；浙江中医药大学校级科研基金项目（重点项目）（2017ZZ09）

△通信作者（电子邮箱：yannoo7376@sina.com）

2017-06-09）