丹参酮ⅡA体外促进黑素瘤A375细胞自噬及信号通路的实验研究

李小静 李志锋 李显平 刘保国 刘志军

056002河北邯郸，河北工程大学附属医院皮肤科

丹参酮ⅡA体外促进黑素瘤A375细胞自噬及信号通路的实验研究

李小静 李志锋 李显平 刘保国 刘志军

056002河北邯郸，河北工程大学附属医院皮肤科

目的探讨丹参酮ⅡA体外对黑素瘤细胞A375细胞自噬的影响及其信号通路研究。方法0.5、1、2、4 mg/L丹参酮ⅡA作用黑素瘤A375细胞24、48、72 h后，噻唑蓝（MTT）比色法检测A375细胞的增殖活性。1、2、4 mg/L丹参酮ⅡA作用黑素瘤A375细胞48 h，采用流式细胞仪检测细胞自噬小体的数量，Western印迹检测自噬相关蛋白Beclin⁃1和微管相关蛋白1轻链3（LC3）⁃Ⅱ蛋白及磷酸肌醇3激酶（PI3K）、蛋白激酶B（Akt）、雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、p70S6激酶1（p70S6K1）蛋白的表达水平。结果MTT分析显示，0.5、1、2和4 mg/L丹参酮ⅡA分别作用黑素瘤A375细胞24、48、72 h，均能抑制A375细胞的增殖能力，且抑制作用呈剂量和时间依赖性（F=2 564.12、1 235.25，均P＜0.05）。流式细胞仪显示，1、2和4 mg/L丹参酮ⅡA作用A375细胞48 h后，细胞内自噬小体比例分别为6.91%±0.35%、13.11%±0.73%、25.51%±0.83%，均明显高于对照组（0.41%±0.02%），各组间差异有统计学意义（均P＜0.05）。Western印迹显示，1、2和4 mg/L丹参酮ⅡA作用A375细胞48 h后，细胞自噬相关蛋白Beclin⁃1和LC3⁃Ⅱ表达水平随丹参酮ⅡA浓度增加而升高，各丹参酮ⅡA组间差异有统计学意义，且高于对照组（均P＜ 0.05）。而PI3K⁃Akt⁃mTOR⁃p70S6K1信号通路中PI3K、p⁃Akt、p⁃mTOR和p⁃p70S6K1蛋白表达随丹参酮ⅡA浓度增加而下降，各丹参酮ⅡA组间差异有统计学意义，且低于对照组（均P＜0.05）。结论丹参酮ⅡA可通过抑制P13K⁃Akt⁃mTOR⁃p70S6K1信号通路，促进黑素瘤细胞发生自噬。

黑色素瘤；丹参酮；自噬；A375细胞

自噬又称Ⅱ型程序性细胞死亡，是真核细胞应对持续性内外刺激而产生的一种非损伤性应答反应。机体通过上调自噬，增强细胞自我清除受损蛋白和细胞器，降解毒性物质，并为细胞生存提供能量［1］。研究显示［2］，在皮肤黑素瘤中，自噬相关基因表达下降。丹参酮ⅡA是中药丹参中提取的一种脂溶性成分，可抑制肿瘤细胞生长，诱导肿瘤细胞凋亡和分化。本文研究丹参酮ⅡA对黑素瘤细胞增殖及自噬表达的影响，并进一步探讨信号传导通路。

材料与方法

一、主要材料

黑素瘤A375细胞购自中国科学院细胞研究所。胎牛血清、胰蛋白酶（美国Gibco公司）；Beclin⁃1、微管相关蛋白1轻链3（microtubule⁃associated protein 1 light chain 3，LC3）⁃Ⅱ抗体（美国Santa Cruz公司）；磷酸肌醇3激酶（PI3K）蛋白、磷酸化（p）⁃蛋白激酶B（Akt）、p⁃雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、p⁃p70S6K1（美国Cell Signaling公司）。丹参酮ⅡA标准品购自中国食品药品检定研究院。

二、方法

1.细胞培养：用含10%胎牛血清的高糖Dulbeccos极限必需培养基（DMEM）培养黑素瘤A375细胞，培养条件为37℃、5%CO2。

2.丹参酮ⅡA溶液的配置：取丹参酮ⅡA标准品20 mg溶于2 ml二甲基亚砜中，充分溶解配置得10g/L丹参酮ⅡA储存液，以每管10μl分装于1.5ml尖底离心管中，封口膜及锡纸封闭，储存于-20℃。以预温的含10%胎牛血清的DMEM稀释10 g/L丹参酮ⅡA储存液1 000倍以上配置不同浓度的丹参酮ⅡA工作液，以使工作液中二甲基亚砜的浓度不超过0.1%，即丹参酮ⅡA工作液最高浓度不超过10mg/L。

3.噻唑蓝（MTT）比色法检测细胞增殖：A375细胞以5×106/L密度接种于96孔板，于37℃、5%CO2条件下培养24 h。0.5、1、2和4 mg/L丹参酮ⅡA分别处理细胞24、48、72 h，对照组加入含0.1%二甲基亚砜的DMEM。每组设置6个复孔。各试验组于实验结束前4 h加入5 g/L MTT 20 μl，培养4 h后弃去培养液，加入二甲基亚砜150 μl于室温振荡15 min使结晶溶解，酶标仪于490 nm处测吸光度（A）值，用A值表示A375细胞增殖活性，以上实验重复3次取均值。

4.流式细胞仪定量检测细胞自噬小体的数量：A375细胞以5×106/L密度接种于6孔板，于37℃、5%CO2条件下培养24 h。1、2和4 mg/L丹参酮ⅡA分别处理细胞48 h，对照组加入含0.1%二甲基亚砜的DMEM。收集各组细胞，用1 mg/L吖啶橙室温避光染色20 min，离心后弃去染液，用1×磷酸盐缓冲液（PBS）清洗3次后，再用1×PBS重悬细胞，上流式细胞仪检测荧光信号，FL1通道检测绿色荧光，FL3通道检测红色荧光，红色荧光的强弱反映细胞内自噬小体的数量，以自噬小体阳性细胞的百分比计算自噬小体的数量。

5.Western印迹检测A375细胞自噬蛋白及信号通路相关蛋白的表达：1、2、4 mg/L丹参酮ⅡA处理A375细胞48 h后，PBS洗涤细胞，加入预冷的蛋白裂解液裂解细胞，收集上清，提取细胞总蛋白，Broadford法测定蛋白含量。取70 μg蛋白上样，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDS⁃PAGE）垂直电泳、聚亚乙烯双氧化物（PVDF）转膜，加入一抗（Beclin⁃1、LC3⁃Ⅱ、PI3K、Akt、mTOR、p70S6K1的稀释比例分别为1∶3 000、1∶4 000、1∶5 000、1∶4 000、1∶4 000、1∶3 000）、二抗（辣根过氧化酶标记抗体，1∶5 000稀释），X线曝光、显影及定影，用各抗体灰度值与3⁃磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）灰度值的比值代表各检测蛋白的相对表达量。每组样本各重复实验3次取均值。

6.统计学方法：采用SPSS13.0统计软件，数据以±s表示，细胞增殖活性分析用重复测量资料的方差分析，其他实验数据用单因素方差分析和SNK检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、丹参酮ⅡA抑制黑素瘤A375细胞增殖活性

0.5、1、2和4 mg/L丹参酮ⅡA分别作用黑素瘤A375细胞24、48、72 h，均能抑制A375细胞的增殖（表1）。重复测量资料的方差分析显示，随时间的延长，丹参酮ⅡA对细胞增殖抑制作用逐渐增强，且有时间依赖性，符合一次直线趋势（F=1235.25，P＜0.05）；随丹参酮ⅡA浓度的增加，细胞增殖抑制率亦逐渐升高，有明显的剂量依赖关系（F=2564.12，P＜0.05）；对照组与不同浓度丹参酮ⅡA组之间在各个时间点的增殖抑制率差异有统计学意义（均P＜0.05）。

二、丹参酮ⅡA促进A375细胞生成自噬小体

1、2和4 mg/L丹参酮ⅡA作用A375细胞48 h后，细胞内自噬小体比例分别为6.91%±0.35%、13.11%±0.73%、25.51%±0.83%，对照组为0.41%±0.02%，各组间差异有统计学意义（F=1013.819，P＜0.001）。SNK检验显示，1、2和4 mg/L丹参酮ⅡA组细胞内自噬小体数量均比对照组多，差异有统计学意义（均P＜0.05），且1、2和4 mg/L丹参酮ⅡA间细胞内自噬小体数量差异亦有统计学意义（均P＜0.05），黑素瘤A375细胞自噬小体数量随丹参酮ⅡA浓度的增加而逐渐增加。

三、丹参酮ⅡA对A375细胞自噬相关蛋白表达的影响

如表2所示，1、2和4 mg/L丹参酮ⅡA作用A375细胞48 h后，细胞自噬相关蛋白Beclin⁃1和LC3⁃Ⅱ表达水平随丹参酮ⅡA浓度增加而升高，各组间差异有统计学意义（均P＜0.001）。SNK检验显示，与对照组相比，1、2和4 mg/L丹参酮ⅡA组Beclin⁃1、LC3⁃Ⅱ蛋白表达均明显增加（均P＜ 0.05），且不同浓度丹参酮ⅡA组间比较蛋白表达均有显著性差异（均P＜0.05），提示丹参酮ⅡA可促进A375细胞发生自噬。

表1 不同浓度丹参酮ⅡA作用A375细胞24、48、72 h后细胞增殖抑制率的比较（%，±s）

表1 不同浓度丹参酮ⅡA作用A375细胞24、48、72 h后细胞增殖抑制率的比较（%，±s）

注：n=6。a：与对照组比较，P ＜ 0.05

组别对照组0.5 mg/L丹参酮ⅡA组1.0 mg/L丹参酮ⅡA组2.0 mg/L丹参酮ⅡA组4.0 mg/L丹参酮ⅡA组24 h 0.02±0.01 8.66±0.47a 13.50±0.87a 19.09±0.84a 34.02±1.12a 48 h 0.09±0.01 12.59±0.71a 18.06±0.65a 23.29±0.52a 40.58±0.58a 72 h 0.10±0.02 18.50±0.74a 24.65±0.96a 32.45±0.64a 51.95±0.20a

表2 丹参酮ⅡA对A375细胞自噬相关蛋白及信号通路的影响（±s）

表2 丹参酮ⅡA对A375细胞自噬相关蛋白及信号通路的影响（±s）

注：n=6。a：与对照组比较，P ＜ 0.05

组别对照组1 mg/L丹参酮ⅡA组2 mg/L丹参酮ⅡA组4 mg/L丹参酮ⅡA组F值P值Beclin⁃1 0.09±0.02 0.33±0.01a 0.53±0.04a 0.63±0.02a 229.884＜0.001 LC3⁃Ⅱ0.21±0.01 0.41±0.01a 0.52±0.02a 0.64±0.02a 431.179＜0.001 PI3K 0.57±0.03 0.40±0.02a 0.25±0.02a 0.09±0.01a 242.138＜0.001 p⁃Akt 0.49±0.02 0.36±0.04a 0.25±0.03a 0.06±0.03a 95.683＜0.001 p⁃mTOR 0.63±0.02 0.47±0.02a 0.36±0.01a 0.20±0.03a 232.699＜0.001 p⁃p70S6K1 0.48±0.03 0.40±0.01a 0.31±0.02a 0.16±0.02a 110.400＜0.001

四、丹参酮ⅡA对A375细胞自噬相关信号通路的影响

如表2所示，1、2和4 mg/L丹参酮ⅡA作用A375细胞48 h后，PI3K⁃Akt⁃mTOR⁃p70S6K1信号通路中PI3K、p⁃Akt、p⁃mTOR和p⁃p70S6K1蛋白表达均逐渐下降，各组间差异有统计学意义（均P＜0.001）。SNK检验显示，1、2和4 mg/L丹参酮ⅡA组PI3K、p⁃Akt、p⁃mTOR和p⁃p70S6K1蛋白表达均低于对照组（均P＜0.05），且各丹参酮ⅡA组间这4种蛋白差异有统计学意义（均P＜0.05）。

讨 论

愈来愈多的研究显示自噬与肿瘤的发生发展关系密切。当细胞的DNA和蛋白质受到损伤的时候，细胞主要通过自噬作用来维持细胞的稳态，若自噬能力下降，DNA受损将会提高肿瘤的发生率［3］。也有研究［4］显示，因肿瘤细胞本身存在凋亡缺陷，主要依靠自噬作用来维持肿瘤细胞的存活。在食道癌中，放射治疗后可诱导癌细胞自噬，从而促进癌细胞增殖进而造成对治疗抵抗［5］。因此自噬对肿瘤细胞有保护和杀伤的双重作用，在肿瘤发生过程中，自噬究竟有利抑或有害的作用尚无定论。有研究［2］认为，肿瘤形成的早期，自噬起到积极作用，当肿瘤进展到晚期，自噬反而能促进癌细胞的存活，起到消极的作用。通过调控癌细胞自噬与凋亡的关系可能在肿瘤的治疗中具有广阔的前景［6］。

恶性黑素瘤的恶性程度较高，且早期极易发生血液和淋巴转移。目前主要采用手术治疗，但不能有效控制复发及远处转移。Hara等［7］检测到细胞自噬相关蛋白Beclin⁃1在发展成熟的黑素瘤中高表达，而在原位黑素瘤中低表达，提示自噬在黑素瘤中呈阶段依赖性。已有研究显示，玫瑰茄叶多酚提取物［8］、姜黄素［9］等可通过自噬来减弱恶性黑素瘤的生长，达到治疗的目的。在皮肤基底细胞癌中，咪喹莫特诱导细胞自噬对肿瘤细胞也产生一定的抑制作用［10］。然而，在其他皮肤恶性肿瘤中发现一些药物可通过下调自噬抑制肿瘤细胞的恶性增殖，如在皮肤鳞癌中，3甲基腺嘌呤通过抑制自噬可以增强癌细胞对化疗反应的敏感性［11］。

丹参酮ⅡA是中药丹参中提取的一种脂溶性成分，可抑制食道癌［12］、结肠癌［13］等多种肿瘤细胞生长，诱导其凋亡和分化，具有良好的抗肿瘤前景。体外研究显示［14］，丹参酮可在细胞内产生活性氧化物诱导肺癌细胞发生保护性自噬和凋亡。丹参酮ⅡA作用白血病KBM⁃5细胞系后，可通过激活AMP依赖的蛋白激酶（AMPK）和细胞外调节蛋白激酶（ERK）抑制mTOR和p70S6K，从而诱导细胞发生自噬性细胞死亡［15］。为了证实丹参酮ⅡA对皮肤黑素瘤的抑制作用及其与自噬的关联性，本研究采取不同浓度的丹参酮ⅡA体外处理黑素瘤A375细胞，MTT检测显示丹参酮ⅡA具有抑制黑素瘤A375细胞增殖的作用，且呈时间和浓度依赖性。

LC3是细胞自噬膜的通用标记物，主要分为两种亚型。当细胞没有发生自噬时，细胞内合成的LC3经过加工，成为胞质可溶性Ⅰ型LC3并常规表达。当机体发生自噬时，Ⅰ型LC3经泛素样加工修饰，与自噬泡膜表面的脑磷脂（PE）结合，成为LC3⁃Ⅱ。由于LC3⁃Ⅱ在自噬晚期阶段表达，其含量在某种程度上反映了细胞的自噬活性，更适用于自噬的检测，主要反映细胞内自噬体数量。Beclin⁃1在促进自噬起始囊泡的形成过程及细胞自噬发生过程中发挥重要作用，与LC3联合检测可反应细胞自噬的活性。本研究显示，丹参酮ⅡA作用A375细胞48 h后，随丹参酮ⅡA浓度的增加，Beclin⁃1和LC3⁃Ⅱ蛋白表达含量均逐渐增加，说明丹参酮ⅡA促进黑素瘤A375细胞发生自噬。自噬上调伴随黑素瘤细胞增殖抑制，提示丹参酮ⅡA可能通过诱导细胞自噬，抑制黑素瘤细胞的增殖，在抗黑素瘤作用中起积极的作用。

PI3K/AKT/mTOR/p70S6K1信号通路在正常细胞生理过程中发挥作用，也是肿瘤细胞生成、增殖和转移过程中的主要调节器。该信号通路的活化可以抑制由多种刺激诱发的细胞凋亡，加快细胞周期进展，从而促进细胞增殖、肿瘤的侵袭和转移。本研究显示，丹参酮ⅡA作用于A375细胞48 h后，随丹参酮ⅡA药物浓度的增加，该通路中PI3K、Akt、mTOR和p70S6K1蛋白的表达均逐渐下降，说明PI3K⁃Akt⁃mTOR⁃p70S6K1通路的活性下降。

综上所述，本研究显示丹参酮ⅡA可能通过抑制PI3K⁃Akt⁃mTOR⁃p70S6K1信号转导通路，促进黑素瘤细胞发生自噬，从而抑制黑素瘤细胞的增殖，为黑素瘤治疗提供一定的理论依据。

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In vitroeffects of tanshinoneⅡA on autophagy of A375 melanoma cells and related signaling pathway

Li Xiaojing,Li Zhifeng,Li Xianping,Liu Baoguo,Liu Zhijun
Department of Dermatology,Affiliated Hospital of Hebei University of Engineering,Handan 056002,Hebei,China

s:Liu Baoguo,Email:LBG66@163.com;Liu Zhijun,Email:zlmdsh@126.com

ObjectiveTo investigatein vitroeffects of tanshinoneⅡA on the autophagy of A375 melanoma cells and related signaling pathway.MethodsSome cultured A375 cells were divided into 5 groups to be treated with tanshinoneⅡA at concentrations of 0.5,1,2 and 4 mg/L,and DMEM containing 0.1%dimethyl sulfoxide（DMSO）,respectively,for 24,48,72 hours.Methyl thiazol tetrazolium（MTT）assay was performed to estimate the proliferative activity of A375 cells.Some cultured A375 cells were divided into 4 groups to be treated with 1,2 and 4 mg/L tanshinone ⅡA（1⁃,2⁃and 4⁃mg/L tanshinone group）,and DMEM containing 0.1%DMSO （control group）,respectively,for 48 hours.Then,flow cytometry was conducted to count autophagosome⁃positive cells,and Western blot analysis to determine protein expression of autophagy⁃associated proteins Beclin⁃1,microtubule⁃associated protein 1 light chain 3（LC3）⁃Ⅱ,phosphatidylinositol 3⁃kinase（PI3K）,protein kinase B（Akt）,mammalian target of rapamycin（mTOR）and p70 ribosomal protein S6 kinase 1（p70S6K1）.ResultsMTT assay showed that 24⁃,48⁃,72⁃hour treatments with tanshinoneⅡA at concentrations of 0.5,1,2 and 4 mg/L all could inhibit the proliferative activity of A375 cells,and the inhibitory effects increased in a dose⁃and time⁃dependent manner（F=2 564.12,1 235.25,bothP＜ 0.05）.The percentage of autophagosome⁃positive cells and protein expression of Beclin⁃1 and LC3⁃Ⅱ increased gradually and significantly in the 1⁃,2⁃and 4⁃mg/L tanshinone groups（autophagosome⁃positive cells:6.91% ±0.35%,13.11% ±0.73%,25.51% ±0.83%,respectively;Beclin⁃1:0.33±0.01,0.53±0.04,0.63±0.02,respectively;LC3⁃Ⅱ:0.41±0.01,0.52±0.02,0.64 ± 0.02,respectively）,after 48⁃hour treatment,which were significantly different between the tanshinone groups（allP＜ 0.05）,and higher in the tanshinone groups than in the control group（0.41% ±0.02%;0.09±0.02;0.21±0.01,allP＜0.05）.However,the protein expression of PI3K,phosphorylated Akt（p⁃Akt）,p⁃mTOR and p⁃p70S6K1 in the PI3K⁃Akt⁃mTOR⁃p70S6K1 signaling pathway decreased gradually and significantly with the increase in tanshinone concentrations after 48⁃hour treatment,and were significantly lower in all the tanshinone groups than in the control group（allP＜ 0.05）.ConclusionTanshinoneⅡA can promote the auophagy of A375 cells,likely by blocking the PI3K⁃Akt⁃mtTOR⁃p70S6K1 signaling pathway.

Melanoma;Tanshinone;Autophagy;A375 cells

刘保国，Email：LBG66@163.com；刘志军，Email：zlmdsh@126.com

10.3760/cma.j.issn.0412⁃4030.2017.01.008

2016⁃05⁃03）

（本文编辑：颜艳）