苯烯莫德对特应性皮炎患者外周血单个核细胞白细胞介素4和10、γ干扰素、T细胞转化因子β水平的影响

马晓蕾 高那 刘政邑 张建中

100044北京大学人民医院皮肤科（马晓蕾、张建中）；北京大学国际医院（马晓蕾、高那、刘政邑）

苯烯莫德对特应性皮炎患者外周血单个核细胞白细胞介素4和10、γ干扰素、T细胞转化因子β水平的影响

马晓蕾 高那 刘政邑 张建中

100044北京大学人民医院皮肤科（马晓蕾、张建中）；北京大学国际医院（马晓蕾、高那、刘政邑）

目的探讨特应性皮炎（AD）患者外周血单个核细胞（PBMC）培养上清液分泌的白细胞介素4（IL⁃4）、γ干扰素（IFN⁃γ）、白细胞介素10（IL⁃10）和T细胞转化因子β（TGF⁃β）水平，及苯烯莫德对这些因子的调节作用。方法分离培养20例AD患者和20例健康对照的外周血单个核细胞，再将20例AD患者外周血单个核细胞等分为4组，分别给以磷酸缓冲盐液（PBS），400 nmol/L苯烯莫德溶液，250 nmol/L地塞米松溶液，10 nmol/L他克莫司溶液共培养后，酶联免疫吸附法检测细胞培养上清液分泌IL⁃4、IFN⁃γ、IL⁃10、TGF⁃β的水平。结果AD组和健康对照组外周血IL⁃4浓度分别为（83.4 ±12.2）pg/ml和（44.3 ± 5.7）pg/ml，两组比较，P＜0.05；TGF⁃β浓度分别为（178.9 ± 17.40）pg/ml和（158.7±18.30）pg/ml，两组比较，P＞0.05。AD组和健康对照组外周血IFN⁃γ浓度分别为（12.5±2.3）pg/ml和（25.4± 3.4）pg/ml，两组比较，P＜0.05；IL⁃10浓度分别为（144.4± 4.1）pg/ml和（189.9± 6.5）pg/ml，两组比较，P＜0.05。400 nmol/l苯烯莫德可降低AD患者外周血IL⁃4、IL⁃10、IFN⁃γ的含量，PBS对照组和苯烯莫德组IL⁃4浓度分别为（83.3 ± 12.2）pg/ml和（50.2 ± 10.1）pg/ml，两组比较，P＜0.05；IL⁃10的浓度分别为（144.4±4.1）pg/ml和（124.7±17.5）pg/ml，两组比较，P＞0.05；IFN⁃γ的浓度分别为（12.5±2.3）pg/ml和（9.56±5.1）pg/ml，两组比较，P＞0.05。苯烯莫德组与地塞米松组，他克莫司组相比，差异无统计学意义（均P＞0.05）。苯烯莫德组可升高PBS对照组AD患者外周血TGF⁃β含量，PBS对照组和BVM组TGF⁃β的浓度分别为（178.9±17.4）pg/ml和（203.6±15.3）pg/ml，两组比较，P＞0.05。苯烯莫德组与地塞米松组，他克莫司组相比，差异无统计学意义（均P＞0.05）。结论苯烯莫德可调节AD患者外周血PBMC IL⁃4、IFN⁃γ、IL⁃10和TGF⁃β的表达水平。

皮炎，特应性；白细胞介素4；白细胞介素10；干扰素γ；淋巴毒素α；苯烯莫德

特应性皮炎（atopic dermatitis，AD），是一种反复发作伴有剧烈瘙痒的慢性炎症性皮肤病，儿童患病率为15%～30%，成人患病率为2%～10%［1］。关于特应性皮炎的治疗，2012年英国特应性皮炎诊疗指南中提出：局部外用糖皮质激素及钙调神经磷酸酶抑制剂是特应性皮炎的一线疗法。糖皮质激素长期应用会产生多毛，局部皮肤变薄，毛细血管扩张等副作用，因此，研制非激素类的新型免疫调节剂成为热点。苯烯莫德（benvitimod）为一种小分子化合物，在一项为期12周的多中心安慰剂对照的双盲临床实验观察发现，外用苯烯莫德乳膏对中重度特应性皮炎有一定的治疗作用［2］。我们前期研究结果表明：苯烯莫德溶液可抑制人外周血单个核细胞（PBMC）增殖，诱导其凋亡，并可以负向调节T细胞NF⁃κB通路［3］。为进一步探讨苯烯莫德对特应性皮炎患者治疗作用，我们检测苯烯莫德溶液对特应性皮炎外周血单个核细胞（PBMC）分泌细胞因子的影响。

对象与方法

1.对象：AD患者20例，年龄18～65岁，平均43.2岁，符合Williams关于AD诊断标准［4］。健康对照20例，年龄22～52岁，平均37.8岁，来源于召募的健康志愿者。两组性别、年龄比较，差异无统计学意义，有可比性。经本院医学伦理委员会批准，受试者均签署知情同意书后，取外周血5 ml，经密度梯度离心法获得PBMC。

2.资料：苯烯莫德原料由北京文丰天济药业有限公司提供，将其用二甲基亚砜（DMSO）溶解配制成100 mmol/L的储存液，保存于-20℃冰箱中。使用前用磷酸盐缓冲液（PBS）稀释成2 mmol/L的工作液，再用此工作液加入PBS进一步稀释成400 nmol/L工作液。地塞米松购自美国Sigma公司，先用DMSO溶解配成浓度为100 mmol/L储存液，保存于-20℃冰箱中，使用前用PBS逐步稀释成终浓度为250 nmol/L的工作液。他克莫司购自美国Sigma公司，先用DMSO溶解配成浓度为100 mmol/L储存液，保存于-20℃冰箱中，使用前用PBS逐步稀释成终浓度为10 nmol/L的工作液，DMSO在以上工作液中的终浓度＜0.1%，其对细胞的影响可忽略不计。人白细胞介素（IL）10、IL⁃4、γ干扰素（IFN⁃γ）、和转化因子β（TGB⁃β）ELISA检测试剂盒购自美国eBioscience公司。

3.方法：单个核细胞分离：取20例患者及20例健康对照肝素抗凝血5 ml，加入淋巴细胞分离液，离心1 600×g，15 min，用滴管吸出单个核细胞，加入5 ml PBS混匀，离心4 800×g，5 min，弃上清液，用含10%的胎牛血清的RPMI1640完全培养基悬浮细胞，使细胞密度为1×106/ml。

单个核细胞培养及分组加药处理：上述单个核细胞以每孔1 ml，5×106/ml的密度接种于24孔板中，将20例AD患者的单个核细胞均分4孔（PBS对照组，苯烯莫德溶液组，地塞米松溶液组，他克莫司溶液组），在37℃、5%CO2环境下孵育24 h，取 900 μl，每孔分别加入浓度4 μmol/L苯烯莫德溶液，2.5 μmol/L地塞米松溶液，100 nmol/L他克莫司溶液，及PBS溶液100 μl，使苯烯莫德终浓度为400 nmol/L，地塞米松终浓度为250 nmol/L，他克莫司终浓度为10 nmol/L。37℃、5%CO2环境下继续孵育24 h，离心收取细胞上清液。样本收齐后进行IL⁃4、IFN⁃γ、TGF⁃β、IL⁃10浓度的检测。

上清液细胞因子的检测：将标准品用1 ml标准品稀释液溶解，然后按需进行稀释，IL⁃4、IFN⁃γ、TGF⁃β、IL⁃10按照浓度梯度制作标准曲线，将不同浓度的标本100 μl分别加入相应孔中，37℃孵育箱60 min，洗板5次，加入生物素化抗体100 μl，封板，37℃孵育箱60 min，洗板5次，加入酶结合物工作液100 μl，洗板，37 ℃孵育箱60 min，洗板5次，加入显色液100 μl，37 ℃避光孵育15 min，加入终止液，混匀在酶标仪上读数A450值，计算细胞因子浓度。

4.统计学分析：用SPSS16.0统计软件分析，计量资料用±s表示。组间的比较用ANOVA和Student Newman Keuls Test进行统计学处理，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

AD患者外周血IL⁃4、TGF⁃β水平较健康对照组高，而IFN⁃γ、IL⁃10水平比健康对照组低。与健康对照组比较，IL⁃4、IFN⁃γ、IL⁃10差异有统计学意义（P＜0.05），TGF⁃β的差异无统计学意义（P＞0.05）。同PBS对照组相比，苯烯莫德可以抑制AD患者外周血PBMC中IL⁃4、IL⁃10、IFN⁃γ的产生，其中IL⁃4降低差异有统计学意义（P＜0.05）。苯烯莫德对AD患者外周血PBMC TGF⁃β的产生有一定促进作用，但差异无统计学意义（P＞0.05）。通过比较，苯烯莫德对AD患者PBMC细胞因子的产生的影响与地塞米松组和他克莫司组相似。见表1，2。

表1 特应性皮炎组与健康对照组白细胞介素4和10、干扰素γ、转化生长因子β变化

表2 苯烯莫德、地塞米松、他克莫司对特应性皮炎患者白细胞介素4和10、干扰素γ、转化生长因子β的影响

讨 论

我们的前期实验表明，苯烯莫德抑制人PBMC增殖的IC50为9.67 μmol/l，苯烯莫德可以诱导人PBMC的早期凋亡和晚期凋亡；当苯烯莫德作用于活化的T细胞后，随着时间的延长，NF⁃κB通路中活化因子p⁃NF⁃κB p65和p⁃IKK表达逐渐降低，而抑制性因子p⁃IκBα表达却逐渐升高，提示苯烯莫德可以负向调节T细胞NF⁃κB通路［3］。特应性皮炎发病机制中辅助性T细胞的作用越来越明显。大规模的二期临床实验中显示出浓度为0.5%的苯烯莫德乳膏对特应性皮炎有良好的治疗效果［2］，因此，我们将0.5%苯烯莫德乳膏换算成相同浓度的溶液，即400 nmol/L的苯烯莫德浓度，进行本研究。

我们的研究结果显示，AD患者外周血IL⁃4，TGF⁃β水平较健康对照组高，而IFN⁃γ，IL⁃10水平比健康对照组低。IL⁃4、IFN⁃γ、IL⁃10的差异有统计学意义（P＜0.05），TGF⁃β的差异无统计学意义（P＞0.05）。苯烯莫德作用于活动期AD的PBMC，可以抑制IL⁃4、IFN⁃γ的水平，与地塞米松和他克莫司相比，无明显差别。提示，苯烯莫德可以扭转Th1/Th2两种CD4+T细胞平衡失衡，治疗AD等Th1/Th2失衡的炎症性疾病。除此，我们的结果还显示AD患者外周血PBMC培养上清液中IL⁃10水平减少，而TGF⁃β水平增高，我们认为IL⁃10的减少，造成了AD患者局部调节免疫的缺陷，促进了AD的炎症形成；增高的TGF⁃β抑制了IFN⁃γ的产生，从而使细胞因子出现Th2/Th1失衡。苯烯莫德可以下调IL⁃10的表达水平，上调TGF⁃β的表达。提示，苯烯莫德对Treg分泌的细胞因子也有一定的调节作用。

［1］Bieber T.Atopic dermatitis［J］.Ann Dermatol,2010,22（2）:125⁃137.DOI:10.5021/ad.2010.22.2.125.

［2］Bissonnette R,Poulin Y,Zhou Y,et al.Efficacy and safety of topical WBI⁃1001 in patients with mild to severe atopic dermatitis:results from a 12⁃week,multicentre,randomized,placebo⁃controlled double⁃blind trial［J］.Br J Dermatol,2012,166（4）:853⁃860.DOI:10.1111/j.1365⁃2133.2011.10775.x.

［3］马晓蕾,温广东,赵琰,等.苯烯莫德对人外周血单个核细胞增殖、凋亡作用及对T细胞NF⁃κB的调节［J］.中国皮肤性病学杂志,2014,28（8）:785⁃788.DOI:10.13735/j.cjdv.1001⁃7089.2014.0785.

［4］赵辨.中国临床皮肤病学［M］.南京:江苏科学技术出版社,2009:739⁃741.

Effects of benvitimod on levels of interleukin⁃4 and ⁃10,interferon⁃γ and transforming growth factor⁃β in patients with atopic dermatitis

Ma Xiaolei,Gao Na,Liu Zhengyi,Zhang Jianzhong
Department of Dermatology,Peking University People′s Hospital,Beijing 100044,China（Ma XL,Zhang JZ）;Peking University International Hospital,Beijing 102206,China（Ma XL,Gao N,Liu ZY）

Zhang Jianzhong,Email:rmzjz@126.com

ObjectiveTo detect levels of interleukin⁃4（IL⁃4）,IL⁃10,interferon⁃γ（INF⁃γ）and transforming growth factor⁃β（TGF⁃β）in the culture supernatant of peripheral blood mononuclear cells（PBMCs）from patients with atopic dermatitis（AD）,and to evaluate regulatory effects of benvitimod on these cytokines.MethodsPBMCs were isolated from 20 AD patients and 20 healthy controls.Then,PBMCs from AD patients were equally divided into 4 groups to be cultured with phosphate⁃buffered saline（PBS group）,400 nmol/L benvitimod solution（benvitimod group）,250 nmol/L dexamethasone solution（dexamethasone group）and 10 nmol/L tacrolimus solution（tacrolimus group）,respectively.Enzyme⁃linked immunosorbent assay（ELISA）was performed to detect levels of IL⁃4,IL⁃10,INF⁃γ and TGF⁃β in the culture supernatant of PBMCs.ResultsCompared with healthy controls,patients with AD showed significantly higher level of IL⁃4（83.4 ± 12.2vs.44.3 ± 5.7 pg/ml,P＜ 0.05）,but lower levels of INF⁃γ（12.5±2.3vs.25.4±3.4 pg/ml,P＜0.05）and IL⁃10（144.4±4.1vs.189.9±6.5 pg/ml,P＜0.05）in peripheral blood.However,no significant difference in the level of TGF⁃β was observed between the patient group and control group（178.9±17.40vs.158.7±18.30 pg/ml,P＞0.05）.Compared with PBS,400 nmol/L benvitimod could decrease the expression of IL⁃4（50.2 ± 10.1vs.83.3 ± 12.2 pg/ml,P＜ 0.05）,IL⁃10（124.7±17.5vs.144.4±4.1 pg/ml,P＞0.05）and INF⁃γ（9.56±5.1vs.12.5±2.3 pg/ml,P＞0.05）,but increase the expression of TGF⁃β（203.6±15.3vs.178.9±17.4 pg/ml,P＞0.05）by PBMCs.In addition,no significant differences in the expression of IL⁃4,IL⁃10,INF⁃γ or TGF⁃β were observed between the benvitimod group and dexamethasone group or tacrolimus group（allP＞ 0.05）.ConclusionBenvitimod can regulate the expression of IL⁃4,IL⁃10,INF⁃γ and TGF⁃β by PBMCs in patients with AD.

Dermatitis,atopic;Interleukin⁃4;Interleukin⁃10;Interferon⁃gamma;Lymphotoxin⁃alpha;Benvitimod

张建中，Email：rmzjz@126.com

10.3760/cma.j.issn.0412⁃4030.2017.01.007

2016⁃05⁃19）

（本文编辑：吴晓初）