阿帕替尼对宫颈癌HeLa细胞体外放射作用的研究

刘 伟，张建文

（西南医科大学附属医院肿瘤科，四川 泸州 646000）

阿帕替尼对宫颈癌HeLa细胞体外放射作用的研究

刘 伟，张建文

（西南医科大学附属医院肿瘤科，四川 泸州 646000）

目的探讨阿帕替尼(apatinib，APA)对宫颈癌HeLa细胞体外放射的作用。方法将对数生长期HeLa细胞分为放疗组和APA联合放疗组。MTT法检测APA对HeLa细胞的增殖抑制，以克隆形成试验观察放射敏感性。结果APA对HeLa细胞抑制率呈浓度依赖性增加，APA联合放疗组细胞克隆数和细胞存活分数明显低于放疗组，APA的放射增敏比(SERD0)为0．851，SERDq为14．919，SERSF2为1．245。结论体外APA对HeLa细胞有增殖抑制作用，联合放疗有增强亚致死性损伤和细胞死亡协同作用。

阿帕替尼；宫颈癌；HeLa细胞；放射治疗；放射敏感性

宫颈癌是女性常见肿瘤之一，2010年和2011年宫颈癌在中国癌症中居第7位和第10位[1－2]。按国际妇产科联盟(FIGO)分期，ⅡB 期后患者占 59．21%(45 ／76)[3]。放射治疗（简称放疗）是宫颈癌主要治疗措施，单纯放疗具有较好疗效，20年总生存率为 71．93%(123／171)，高于根治性手术 71．51%(123 ／172)，但仍有 27．41%(94 ／343)出现复发[4]。顺铂(cisplatin，DDP)是局部进展期宫颈癌同步放化疗常用药物[5]，但严重的胃肠道反应是限制其广泛应用的主要因素。阿帕替尼(apatinib，APA)作为一种新的抗血管生成药物，对血管内皮生长因子(VEGF)受体(VEGFR)具有高度选择性，在宫颈癌中应用研究报道较少，联合放疗是否具有放射增敏作用尚未明确。本研究中观察了APA联合放疗对宫颈癌的放射增敏作用，为宫颈癌抗血管生成联合放疗提供参考。现报道如下。1 材料与方法

1．1 材料

APA(江苏恒瑞医药股份有限公司，规格为每片0．425 g)；噻唑蓝(MTT，美国 Solarbio 公司)；DMEM 高糖培养基(美国Gibco公司)；胎牛血清（美国HyClone公司）；结晶紫(上海碧云天生物技术有限公司)；人宫颈癌HeLa细胞株(西南医科大学肿瘤科实验室提供)；酶标仪（美国BIO－RAD公司）；直线加速器(Elekta)。

1．2 细胞培养与分组

HeLa细胞传代培养于DMEM培养液中，37℃，5%CO2条件下贴壁生长。取对数生长期HeLa细胞进行试验。试验设放疗组(RT)和APA联合放疗组(APA＋RT)。

1．3 药物配制与照射条件

用二甲基亚砜（DMSO）溶液溶解APA，配制成有效质量浓度为3 g／L的APA溶液，于－20℃保存。采用直线加速器照射，SSD＝100 cm，射野40 cm×40 cm，单次照射剂量2 Gy。

1．4 药物毒作用

1．4．1 APA 的细胞毒作用

HeLa细胞按照4 000个细胞／孔接种于96孔培养板中，分为对照组和药物处理组，每组均设置5个平行复孔，置孵箱继续培养，24 h细胞贴壁后，加入含APA或 DDP 的培养基 100 μL，使 APA 浓度为 0，4，8，16，32，64 μmol／L，置孵箱继续培养 24 h 后，各孔加入 5 g ／L的MTT 20 μL，培养箱内继续孵育4 h后，吸去培养基，每孔加入150 μL DMSO，置摇床上低速均匀地振荡10 min，采用酶标仪（RT－PCR）下测定每孔490 nm波长处的吸光度值(OD)，计算不同浓度下的抑制率，绘制不同浓度APA对HeLa细胞的生长抑制曲线，采用SPSS 17．0软件计算APA的抑制浓度(IC50和 IC20)。以上试验均重复3次。

1．4．2 细胞克隆形成率[6]

每个培养皿中接种 200，300，400，800，1 000 个HeLa细胞，培养12 h（即细胞贴壁）后，药物联合放疗组分别加入终浓度为 11．46 μmol／L 的 APA，1 μmol／L 的DDP。24 h后对相应组行 0，2，4，6，8 Gy照射，每个剂量设3个平行样本。继续培养10～14 d，形成肉眼可见的细胞克隆，终止培养，甲醇固定后冲洗，结晶紫染色。显微镜下以≥50个细胞作为1个集落，计算各组平均值及不同照射剂量下存活分数(SF)。试验重复3次，以平均值进行分析，根据单击多靶数学模型，采用GraphPad Prism 5软件拟合HeLa细胞的存活曲线。并求出相应放射生物学参数(D0，Dq，N，SF2)，计算放射增敏比(SERD0)，SERDq和SERSF2，比较不同组间的放射作用。

贴壁率(PE)＝(对照组克隆数／接种细胞数)×100%

SF＝不同剂量组克隆数／(接种细胞数×PE)

2 结果

2．1 APA的 IC50和 IC20

当 APA 有效浓度为 4， 8，16，32， 64 μmol／L 时，相应 的 抑 制 率 分 别 为 12．34% ， 21．05% ， 35．24% ，62．38% ，81．23% ，经计算，APAIC50为 27．160 μmol／L，IC20为 11．462 μmol／L。选择 IC20作为后续试验药物浓度。详见图1。

2．2 APA对HeLa细胞的增殖作用

不同浓度APA作用后，APA对HeLa细胞积分光OD随浓度增加而降低，抑制率随浓度增加而增加，均表现为浓度依赖性。详见表1。

2．3 APA对HeLa细胞的放射增敏作用

随放疗剂量增加，两组细胞克隆数和SF明显降低，APA＋RT组细胞克隆数和SF明显低于RT组，且SF2降低0．105。APA＋RT组细胞克隆数和集落大小明显小于RT组。根据单击多靶模型拟合细胞存活曲线，并计算放射生物学参数 Do，Dq，N，SF2及 SER，APA 的 SERD0为 0．851，SERDq为 14．919，SERSF2为 1．245。详见表 2、表3及图2。

图1 APA的细胞毒性

表1 不同浓度APA HeLa细胞积分 OD及抑制率

3 讨论

表2 两组APA作用HeLa细胞后克隆数及SF(±s)

表2 两组APA作用HeLa细胞后克隆数及SF(±s)

组别 0 Gy 2 Gy 4 Gy RT组APA＋RT组克隆数116．667 ± 3．512 118．667 ± 4．933 SF 1．000 1．000克隆数93．667 ± 4．509 75．333 ± 2．517 SF 0．534 ± 0．026 0．429 ± 0．014克隆数50．333 ± 2．517 45．333 ± 3．055 SF 0．215 ± 0．011 0．194 ± 0．013组别 6 Gy 8 Gy RT组APA＋RT组克隆数47．667 ± 4．509 39．333 ± 3．512 SF 0．102 ± 0．010 0．084 ± 0．008克隆数15．667 ± 3．055 15．333 ± 1．528 SF 0．027 ± 0．005 0．026 ± 0．003

表3 两组放射生物学参数

目前，临床常用的抗血管生成药物主要有重组人血管内皮抑制素、贝伐珠单抗等，这类抗血管生成药物有明显肿瘤抑制作用和放射增敏作用。肺癌A549细胞重组人血管内皮抑制素联合放疗研究中，其能明显抑制肺癌A549细胞株的生长，联合放疗能降低VEGF表达并增强放射敏感性[7]。研究表明，贝伐珠单抗联合放疗能明显抑制头颈部肿瘤SCC1及肺癌H226细胞株移植瘤的生长，且能显著改善恶性胶质瘤患者的无进展生存期和总体生存期[8－9]。APA在肝内胆管细胞癌中作用表明，APA通过抑制VEGF信号自分泌环，促进胆管细胞癌细胞凋亡[10]。APA为2014年才在中国上市的口服抗血管生成药物，主要用于进展期胃癌的治疗[11－12]，缺乏用于宫颈癌治疗的报道。

图2 联合放疗组细胞克隆数和存活曲线

以顺铂为基础的同步放化疗是局部进展期宫颈癌的标准治疗模式[13－14]，虽取得了可观的临床疗效，但严重的胃肠道不良反应是患者难以耐受的主要原因。研究表明，在宫颈癌细胞中VEGF－mRNA及VEGF相关蛋白的表达显著高于正常宫颈细胞，且放疗后的宫颈癌细胞VEGF表达进一步增加，从而促进肿瘤细胞增殖、生长、转移[11，15－16]。因此，抑制 VEGF 相关信号通路可能是宫颈癌治疗的另一重要治疗手段。抗血管生成药物是抑制VEGF相关信号通路的主要方式，APA联合放疗是否能增强宫颈癌放射敏感性，有待进一步研究。

APA联合放疗用于肿瘤治疗的文献报道较少，明确仅报道1例胃癌患者APA联合放疗，患者生存16个月，治疗期间肿瘤变化明显[12]，用于更多肿瘤与放疗联合报道缺乏，贝伐珠单抗联合放疗在宫颈癌中可获得较好疗效[17]，但缺乏APA联合放疗用于宫颈癌联合体内外放疗的报道。

本研究结果发现，APA体外放射对Hela细胞存在增殖抑制作用，且呈浓度依耐性。不同浓度APA作用后，APA对HeLa细胞积分 OD随浓度增加而降低，抑制率随浓度增加而增加，均表现为浓度依赖性。当APA浓度达到32 μmol／L时，HeLa细胞抑制率成倍增加。APA对肿瘤的增殖抑制作用可能与上调了 P53，caspase－3和caspase－8 的表达有关[18－19]。随着放疗剂量增加，放疗组和联合放疗组细胞克隆数和SF2结果与文献[20]报道相似。APA的SERD0小 于 1(0．851)，但 SERDq和SERSF2均大于 1(分别为 14．919 和 1．245)，提示 APA联合放疗无明显放射增敏作用，但具有明显增强亚致死性损伤作用，该作用比放疗组高0．863，在相同剂量条件下，具有明显增强细胞死亡作用，比放疗组高0．105。

综上所述，APA联合放疗具有明显呈浓度依耐性的增殖抑制作用，虽无明显放射增敏作用，但有明显增强亚致死性损伤和细胞死亡协同作用。因此，APA联合放疗具有协同抗肿瘤作用。随着研究的深入，APA联合放疗在宫颈癌中的作用机制会越来越明显确，有可能为宫颈癌治疗带来新的希望。

[1]Chen W，Zheng R，Zeng H，et al．Annual report on status of cancer in China，2011[J]．Chin J Cancer Res，2015，27(1):2 － 12．

[2]Chen W，Zheng R，Zhang S，et al．Annual report on status of cancer in China，2010[J]．Chin J Cancer Res，2014，26(1):48 － 58．

[3]Lee J，Lin JB，Sun FJ，et al．Safety and efficacy of semiextended field intensity－modulated radiation therapy and concurrent cisplatin in locally advanced cervical cancer patients:An observational study of 10 － year experience[J]．Medicine(Baltimore)，2017，96(10):e6158．

[4]Landoni F，Colombo A，Milani R，et al．Randomized study between radical surgery and radiotherapy for the treatment of stageⅠB－ⅡA cervical cancer:20 － year update[J]．J Gynecol Oncol，2017，28(3):e34．

[5]Lin JF，Berger JL，Krivak TC，et al．Impact of facility volume on therapy and survival for locally advanced cervical cancer[J]．Gynecol Oncol，2014，132(2):416 － 422．

[6]Zhuang HQ，Sun J，Yuan ZY，et al．Radiosensitizing effects of gefitinib at different administration times in vitro[J]．Cancer Sci，2009，100(8):1520 － 1525．

[7]Zhang L，Ge W，Hu K，et al．Endostar down－regulates HIF －1 and VEGF expression and enhances the radioresponse to human lung adenocarcinoma cancer cells[J]．Mol Biol Rep，2012，39(1):89－95．

[8]Narayana A， Gruber D， Kunnakkat S， et al．A clinical trial of bevacizumab， temozolomide， and radiation for newly diagnosed glioblastoma[J]．J Neurosurg，2012，116(2):341 － 345．

[9]Hoang T，Huang S，Armstrong E，et al．Enhancement of radiation response with bevacizumab[J]．J Exp Clin Cancer Res，2012，31(1):37．

[10]Peng H，Zhang Q，Li J，et al．Apatinib inhibits VEGF signaling and promotes apoptosis in intrahepatic cholangiocarcinoma[J]．Oncotarget，2016，7(13):17220 － 17229．

[11]Lin Y，Zhai E，Liao B，et al．Autocrine VEGF signaling promotes cell proliferation through a PLC－dependent pathway and modulates Apatinib treatment efficacy in gastric cancer[J]．Oncotarget，2017，8(7):11990 － 12002．

[12]Zhang M， Deng W，Cao X， et al．Concurrent apatinib and local radiation therapy for advanced gastric cancer:A case report and review of the literature[J]．Medicine(Baltimore)，2017，96(9):e6241．

[13]Li H，Lu Y，Pang Y，et al．Propofol enhances the cisplatininduced apoptosis on cervical cancer cells via EGFR ／JAK2 ／STAT3 pathway[J]．Biomed Pharmacother，2017，86:324 － 333．

[14]Liu J，Liu J，Guo SY，et al．HSP70 inhibitor combined with cisplatin suppresses the cervical cancer proliferation in vitro and transplanted tumor growth:An experimental study[J]．Asian Pac J Trop Med，2017，10(2):184 － 188．

[15]Zhang L，Chen Q，Hu J，et al．Expression of HIF －2 and VEGF in cervical squamous cell carcinoma and its clinical significance[J]．Biomed Res Int，2016(2016):5631935．

[16]Qi L，Xing LN，Wei X，et al．Effects of VEGF suppression by small hairpin RNA interference combined with radiotherapy on the growth of cervical cancer[J]．Genet Mol Res，2014，13(3):5094－5106．

[17]Schefter T，Winter K，Kwon JS，et al．RTOG 0417:efficacy of bevacizumab in combination with definitive radiation therapy and cisplatin chemotherapy in untreated patients with locally advanced cervical carcinoma[J]．Int J Radiat Oncol Biol Phys，2014，88(1):101 － 105．

[18]Lin C，Wang S，Xie W，et al．Apatinib inhibits cellular invasion and migration by fusion kinase KIF5B－RET via suppressing RET ／Src signaling pathway[J]．Oncotarget，2016，7(37):59236－59244．

[19]姜增凯，叶晓歌，陈琴华．阿帕替尼对肝癌细胞增殖和迁移能力的影响研究[J]．中国临床药理学杂志，2016，32(15):1422－1424．

[20]Plastaras JP，Kim SH，Liu YY，et al．Cell cycle dependent and schedule－dependent antitumor effects of sorafenib combined with radiation[J]．Cancer Res，2007，67(19):9443 － 9454．

Radiate Effect of Apatinib on Human Cervical Carcinoma HeLa Cells in Vitro

Liu Wei,Zhang Jianwen
(Department of Oncology,The Affiliated Hospital of Southwest Medical University，Luzhou,Sichuan,China 646000)

Objective To investigate the radiate effect of apatinib(APA)on human cervical carcinoma HeLa cells in vitro．M ethods HeLa cells with logarithmic phase were divided into radiotherapy group and APA combined radiotherapy group．Proliferation inhibition of HeLa cell from APA was detected by MTT,the radiosensitivity of HeLa cell was observed by clone formation assay．Results Proliferation inhibition of HeLa cell from APA was a concentration － dependent increase．Cell clone number and cell survival fraction of the APA combined radiotherapy group were lower than the radiotherapy group．Sensitization enhancement ratio(SERD0)of APA was 0．851,SERDqwas 14．919 and SERSF2was 1．245．Conclusion APA has the proliferation inhibition role to HeLa cell in vitro,combined with radiotherapy can enhance the synergistic effect of sublethal injury and cell death．

apatinib;cervical cancer;HeLa cell;radiotherapy;radiosensitivity

R965．3；R979．1

A

1006－4931(2017)19－0027－04

10．3969 ／j．issn．1006 － 4931．2017．19．007

中国临床肿瘤学科学基金，CSCO－恒瑞肿瘤研究基金项目[Y－HR2016－046]。

刘伟，男，在读硕士研究生，研究方向为肿瘤放化综合治疗，（电子信箱）18715798944＠163．com。

张建文，男，主任医师，硕士研究生，研究方向为肿瘤放化综合治疗，（电子信箱）zhangjianwen66＠126．com。

2017－06－11)