适宜黑牛肝菌菌丝生长的合成培养基及主要环境条件*

罗顺珍，纪光玉，纪光燕，黄海涛，金 福，纪开萍

（云南省景洪市宏臻农业科技有限公司，云南 景洪 666100）

适宜黑牛肝菌菌丝生长的合成培养基及主要环境条件*

罗顺珍，纪光玉，纪光燕，黄海涛，金 福，纪开萍**

（云南省景洪市宏臻农业科技有限公司，云南 景洪 666100）

在以马铃薯为主要成分的半人工合成培养基基础上，研究替代马铃薯的全合成培养基及主要环境条件（温度、pH）对黑牛肝菌（Phlebopus portentosus）菌丝生长的影响。结果表明，半人工合成培养基去除马铃薯，增加尿素、硫酸铵、蛋白胨等氮源0.5 g·L-1和氧化钙（无机盐0.2 g·L-1）对黑牛肝菌菌丝生长有很明显的促进作用。主要环境条件中，适宜温度为28℃～33℃，适宜pH为5～7。

黑牛肝菌；合成培养基；营养需求；环境条件

黑牛肝菌 [Phlebopus portentosus（Berk.&Broome）Boedi jn.]，又名暗褐网柄牛肝菌，隶属于担子菌门（Basi-diomycota） 伞菌纲 （Agaricomycetes） 牛肝菌目（Boletales） 小牛肝菌科（Boletinellaceae） 脉柄牛肝菌属（Phlebopus）[1]，分布于斯里兰卡、越南、印度尼西亚、泰国、巴西、墨西哥、澳大利亚、新西兰等国家，国内广西、海南、云南等省均有分布[2-7]，其子实体味道鲜美，营养丰富，具有很高的经济价值。目前黑牛肝菌已实现人工栽培[8]，液体菌种是黑牛肝菌人工栽培及工厂化栽培的发展方向。本研究旨在用合成培养基代替以马铃薯为主要营养成份的半人工培养基，培养液体菌种用于黑牛肝菌人工栽培制种，降低成本，缩短菌丝培养周期，提高黑牛肝菌的生产效益。根据何明霞等[9]暗褐网柄牛肝菌菌丝培养基的碳源、氮源及无机盐的筛选研究，以及以黑牛肝菌菌丝体培养基的碳源、氮源及无机盐的筛选研究中所用的碳源、氮源、无机盐种类及使用的量作为参考[10-12]，精细化培养基，以求找到代替马铃薯的配方，达到减小生产成本的目的。

1 材料与方法

1.1 材料

供试菌株：宏臻农业科技有限公司生产所用菌株HZ14080；以马铃薯为主要成分的半人工合成培养基M1；去除马铃薯半人工合成培养基M2。

1.2 方法

1.2.1 碳源实验

在培养基M2中分别添加2 g·L-1的葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、淀粉，观测不同碳源对黑牛肝菌菌丝生长的影响。

1.2.2 氮源试验

在培养基M2中分别添加0.5 g·L-1的牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、氯化铵、酒石酸铵、硝酸钾、尿素等，观测不同氮源对黑牛肝菌菌丝生长的影响。

1.2.3 无机盐试验

在培养基M2中分别添加0.2 g·L-1的硫酸镁、氯化钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、硝酸钾、氧化钙、碳酸钙、氯化钠、酒石酸钾钠等。观察不同无机盐对黑牛肝菌菌丝生长的影响。

1.2.4 温度试验

以M1为菌丝生长培养基，设置25℃、27℃、29℃、31℃、33℃五个温度梯度，观测不同温度对黑牛肝菌菌丝生长的影响。

1.2.5 pH试验

以M1为菌丝生长培养基，设置pH为4、5、6、7、8五个梯度的基础培养基（用0.1 mol·L-1NaOH和0.1 mol·L-1HCl调节pH，使用pH计进行pH测量）[10]。观测不同pH对黑牛肝菌菌丝生长的影响。

1.2.6 接种培养与数据分析

所有试验均于平板中央接种1块直径7 mm的活化菌丝块，于29℃下恒温培养（温度试验则在设定的恒温下培养），定期（10 d、15 d、20 d、25 d、30 d）用十字交叉法[11]，测量菌落直径；每一试验每一处理设3次重复，试验结果进行统计分析，采用LSD法比较差异显著性。

2 结果与分析

2.1 碳源对黑牛肝菌丝生长的影响

碳源对黑牛肝菌丝菌丝生长的影响情况见表1、图1。

表1 不同碳源对黑牛肝菌菌丝生长速度及生长势的影响Tab.1 Effects of different carbon sources on growth rate and growth potential of Phlebopus portentosus mycelium

图1 M2培养基中加入不同碳源后菌丝生长情况Fig.1 Growth of the Phlebopus portentosus mycelium in the M2 medium added the different carbon sources

表1和图1结果表明，菌丝在M1培养基上生长速度最快0.25 cm·d-1，M2基础培养基中加入5种不同碳源时菌丝生长速度反而变慢，M2中添加蔗糖、果糖、淀粉、乳糖、葡萄糖后菌丝平均每天生长速度分别为 0.222 cm·d-1、0.223 cm·d-1、0.202 cm·d-1、0.222cm·d-1、0.225 cm·d-1。从图 1 可以看出，M2 培养基加入不同碳源后，培养至第10天时不同碳源间菌丝长势差异明显，第15天时菌丝长势相似，第20天时添加淀粉的菌丝长势最差，对照M1中菌丝长势最好；第20天至第30天时依然是添加淀粉的菌丝长势最差，对照M1中菌丝长势最好；添加蔗糖、葡萄糖、果糖、乳糖的菌丝长势虽然有浮动，但浮动不大。结合表1结果，得出在试验所用的基础培养基中分别添加葡萄糖、果糖、蔗糖、淀粉、乳糖时菌丝的生长速度慢，与对照相比存在显著差异。在试验中观察到额外添加碳源的实验中菌丝颜色变黑，极易出现菌丝不长和老化的现象。

综合试验结果得出，M2培养基中无需再增加碳源，马铃薯在培养基M2中主要的作用并非提供碳源成分，M2培养基中的碳源已为最佳用量，故无需再加入其他碳源。

2.2 氮源对黑牛肝菌菌丝生长的影响

培养基M2加入不同氮源对黑牛肝菌菌丝生长的影响见表2、图2。

表2 不同氮源对牛肝菌菌丝生长速度和生长势的影响Tab.2 Effects of different nitrogen sources on growth rate and growth potential of Phlebopus portentosus mycelium

图2 M2培养基中加入不同氮源后菌丝生长情况Fig.2 Growth of the Phlebopus portentosus mycelium in the M2 medium added the different nitrogen sources

从图2和表2可知，在试验所用的基础培养基中分别添加0.5 g·L-1的牛肉膏、蛋白胨、酵母浸膏、氯化铵、硫酸铵、硝酸钾、尿素时，与对照相比，菌丝的长势优于未加氮源的M2。其中尿素明显促进菌丝生长，在加入尿素的M2培养基上菌丝生长最快且最为健壮，边缘整齐，颜色呈嫩黄色，与其他氮源处理菌丝生长速度相比差异达极显著水平。尿素是完全合成培养基中牛肝菌菌丝生长的最佳氮源，其次是酵母浸膏、硫酸铵、牛肉膏和蛋白胨。综合结果可知，黑牛肝菌菌丝培养中，马铃薯可能提供部分的氮源成分，同时亦可以说明无机氮源和有机氮源可以进行复合使用，且在原有的配方上可以适量调整碳氮比。

本实验中，M2添加尿素促进菌丝的生长，与何明霞等[12]在氮源筛选时尿素抑制菌丝生长的结论相反，有待于进一步试验和验证。

2.3 无机盐对黑牛肝菌菌丝生长的影响

不同无机盐对黑牛肝菌菌丝生长的影响结果见表3、图3。

表3 不同无机盐对黑牛肝菌菌丝生长速度及生长势的影响Tab.3 Effects of different inorganic salts on growth rate and growth potential of Phlebopus portentosus mycelium

图3 M2培养基中加入不同无机盐后菌丝生长情况Fig.3 Growth of Phlebopus portentosus mycelium in M2 medium added the different inorganic salts

在M2添加9种无机盐，均对菌丝的生长有抑制作用，且易出现菌丝老化，但添加氧化钙或碳酸钙时，菌丝比对照菌丝粗壮。加入磷酸二氢钾时，对菌丝的抑制作用最为显著。

2.4 pH对黑牛肝菌菌丝生长的影响

不同pH对黑牛肝菌菌丝长势的影响见图4。

根据图4可以得出，黑牛肝菌在pH4～8的范围内均可生长，pH5～7为适宜的pH范围。在此范围内，不同pH处理的菌丝生长速度间差异不显著，但与其他pH处理的菌丝生长速度间差异达显著或极显著水平。pH小于8时，菌丝不仅生长速度快，而且生长健壮，随着pH的升高，菌丝生长速度减慢，而且细弱。pH为5时菌丝生长速度最快、最健壮，pH为8时菌丝长势最差。可以看出菌丝的长势随pH升高，生长速度减慢。不同pH对菌丝的生长有一定的影响，但影响不大，黑牛肝菌菌丝适宜pH范围与褐环粘盖牛肝菌菌丝生长的pH范围相同[13]。

图4 不同pH对黑牛肝菌菌丝长势的影响Fig.4 Influence of different pH value on the growth potential of Phlebopus portentosus mycelium

2.5 温度对黑牛肝菌丝生长的影响

不同培养温度对黑牛肝菌丝长势的影响情况见图5。

图5 不同培养温度对黑牛肝菌菌丝长势的影响Fig.5 NInfluence of different culture temperature on the growth potential of Phlebopus portentosus mycelium

黑牛肝菌在25℃～33℃菌丝均能生长。31℃时，菌丝生长速度最快，达2.46 mm·d-1，超过31℃，菌丝生长速度迅速下降；在25℃菌丝生长速度最慢。试验中黑牛肝菌菌丝生长的适宜温度为27℃～31℃，与王文斌等[12]暗褐网柄牛肝菌菌丝深层发酵培养实验中得出牛肝菌菌丝适宜生长温度为29℃～31℃基本一致。菌丝的生长速度快，有利于缩短黑牛肝菌的生长周期。缩短菌丝生长周期对减少生产成本有重大意义。

3 讨论

黑牛肝菌作为优质珍稀食用菌，其生物学特性、遗传育种和高产栽培研究在我国的报道尚不多见。关于牛肝菌培养基配方的试验有很多的报道，其中以何明霞等[9]黑牛肝菌菌丝体培养基的碳源、氮源及无机盐的筛选研究中得出的结果重复性更强，更有借鉴作用。

目前食用菌大多采用半人工培养基进行培养，很少有合成培养基的相关报道。试验借助于前人对牛肝菌培养基的研究，主要突破点，即找到代替马铃薯的物质，得出化学成分及物质含量的准确数值，从而使生产及分析更方便快捷。

氮源试验中，在试验所用的基础培养基中添加适量的氮源时，如尿素、硫酸铵、蛋白胨等，对菌丝的生长有促进作用，且菌丝生长健壮。同时在黑牛肝菌栽培中，无机氮源和有机氮源可以进行复合使用，且在原有的配方上可以适量调整碳氮比。

研究结果表明，牛肝菌菌丝在20℃～35℃时均能生长；在本试验中，黑牛肝菌菌丝在31℃生长速度更快。菌丝生长速度快有利于缩短黑牛肝菌的生长周期，减少生产成本。

黑牛肝菌菌丝生长的pH范围为4～10，最适pH范围为5～7。但用自来水配出的培养基pH为5.8左右，为简化生产所以不调整pH。

[1]曹旸，纪开萍，刘静，等.暗褐网柄牛肝菌人工栽培中不同覆土材料理化性质及其对出菇的影响[J].云南农业科技，2012（1）：10-11.

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Synthetic Medium and Main Environmental Conditions Suitable for Mycelium Growth of Phlebopus portentosus

LUO Shun-zhen,JI Guang-yu,JI Guang-yan,HUANG Hai-tao,JIN Fu,JI Kai-ping
(Hongzhen Agricultural Science and Technology Co.Ltd.,Jinghong 666100,China)

On the basis of half synthetic medium with potato as the main composition,the effect of whole synthetic medium and environmental conditions on mycelium growth of Phlebopus portentosus was studied.The results showed that the semi-artificial medium was used to remove the potato and increase the nitrogen sources such as urea,ammonium sulfate,peptone(0.5 g·L-1)and calcium oxide(inorganic salt 0.2 g·L-1),which had a significant effect on the mycelium growth of P.portentosus.The optimum growth temperature of P.portentosus was 28℃-33℃,pH was 5-7.

Phlebopus portentosus;synthetic medium;nutritional requirements;environmental conditions

S646.9

A

1003-8310（2017）05-0045-05

10.13629/j.cnki.53-1054.2017.05.011

云南省科技富民强县计划（2015EB056）；西双版纳州科技三项费（201504）。

罗顺珍（1992-），女，本科，实习研究员，主要从事黑牛肝菌栽培研究。E-mail:515170711@qq.com

2017-07-15