不同产地刺五加药材高效液相色谱指纹图谱研究

罗 旭，唐小龙，杨宋琪，陈海燕，柯 潇

（四川济生堂药业有限公司，四川 成都 611930）

不同产地刺五加药材高效液相色谱指纹图谱研究

罗 旭，唐小龙，杨宋琪，陈海燕，柯 潇

（四川济生堂药业有限公司，四川 成都 611930）

目的建立绘制刺五加药材指纹图谱的高效液相色谱（HPLC）法。方法色谱柱为Agilent HC－C18(2)柱（250 mm×4.6 mm，5 m），流动相为乙腈 －水（梯度洗脱），检测波长为210 nm，柱温为35℃，流速为1.0 mL／s，分析时间为60 min。结果刺五加色谱图中共标示14个色谱峰，用指纹图谱相似度软件测定10批刺五加药材指纹图谱的相似度均在0.90～1.00之间。结论该方法准确，重复性好，可为刺五加药材的质量控制提供有力依据。

刺五加；高效液相色谱法；指纹图谱；相似度

以刺五加药材为原料的制剂较多，如刺五加注射液、刺五加脑灵液、救尔心胶囊、刺五加胶囊、刺五加片等。刺五加也是我公司产品舒肝解郁胶囊的主要成分之一，为五加科植物刺五加 Acanthopanax senticosus（Rupr.et Maxim.） Harms 的干燥根和根茎或茎[1]，主要分布在我国东北和河北、山西等地，具有益气健脾、补肾安神的功效，用于治疗脾肾阳虚、体虚乏力、食欲不振、腰膝酸痛、失眠多梦等症[2]。刺五加主要含苷类、糖类、皂苷类等多种化学成分[3－4]，其中刺五加糖苷类是抗疲劳、抗肿瘤、免疫调节、抗衰老的主要生物活性成分[5－8]。目前，中药指纹图谱对于推动中药现代化、产业化、国际化具有重大作用。本研究中采用高效液相色谱（HPLC）法绘制了刺五加药材的指纹图谱，为刺五加药材的整体质量控制提供了有效方法。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1100型高效液相色谱仪，含Agilent Chemstation化学工作站（美国安捷伦公司）；BP－211D型十万分之一电子天平（德国赛多利斯公司）；KQ250DE型超声波清洗器（昆山市仪器有限公司）。

1.2 试药

紫丁香苷对照品（批号为111574－201504，纯度为94.9%），刺五加苷 E对照品（批号为111713－201403，纯度为 98.1%），异嗪皮啶对照品（批号为 110837－201206，纯度为99.5%），均购自中国食品药品检定研究院；乙腈（美国Fisher公司）为色谱纯；水为超纯水，甲醇为分析纯；刺五加药材采购于黑龙江伊春不同产地，由成都康弘药业集团国家企业技术中心叶亮教授鉴定为五加科植物刺五加 Acanthopanax senticosus（Rupr.et Maxim.）Harms的干燥根和根茎或茎（批号分别为160901， 160902， 160903， 160904， 160905， 160906，160907，160908，160909，160910）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent HC －C18(2)柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流动相：以乙腈为流动相A，以水为流动相B，按表1中的条件进行梯度洗脱；检测波长：210 nm；柱温：35 ℃；流速：1.0 mL ／s。

表1 流动相梯度洗脱表

2.2 溶液制备

供试品溶液：取本品粉末（过3号筛）约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入80%甲醇20 mL，称定质量，超声处理（功率 250 W，频率 40 kHz）30 min，取出，放冷，再称定质量，用80%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，即得。

参照物溶液：取紫丁香苷对照品、刺五加苷E对照品、异嗪皮啶对照品，精密称定，加甲醇（刺五加苷E先加50%甲醇溶解）分别制成每1 mL含紫丁香苷20，20，5 μg 的溶液，即得。

2.3 测定方法与方法学考察

分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定，记录55 min的色谱图。

精密度试验：取刺五加药材，依法制备供试品溶液，在拟订色谱条件下，连续进样5次，记录色谱图。结果各色谱峰的相对保留时间和其相对峰面积比值一致，RSD均小于3.0%，达到指纹图谱技术要求。

重复性试验：精密称取刺五加药材5份，依法制备供试品溶液，在拟订色谱条件下进行分析并记录色谱图。结果各色谱峰的相对保留时间和其相对峰面积比值一致，RSD均小于3.0%，达到指纹图谱技术要求。

稳定性试验：精密称取刺五加药材，依法制备供试品溶液，在拟订色谱条件下，分别于 1，8，16，24，48 h 时记录色谱图。结果各色谱峰的相对保留时间和其相对峰面积比值一致，RSD均小于3.0%，达到指纹图谱技术要求。

2.4 指纹图谱共有指纹峰标定

根据10批不同产地的刺五加供试品指纹图谱的检测结果（图1），总结出供试品指纹图谱的14个典型色谱峰（图2），其中6号峰为紫丁香苷色谱峰。紫丁香苷是刺五加的有效成分之一，将其作为内参比峰，各峰相对保留时间、相对峰面积结果见表2。

图1 10批刺五加药材指纹图谱

图2 刺五加标准指纹图谱

2.5 指纹图谱相似度检验

采用国家药典委员会开发的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版”，该软件有生成对照图谱功能，并进行相似度计算。根据10批刺五加药材色谱指纹图谱建立的共有模式，利用指纹图谱相似度计算软件，以夹角余弦作为测度，计算样品与共有模式的相似度。结果见表3。

表2 各批次刺五加相对保留时间和相对峰面积

表3 10批刺五加指纹图谱相似度检验结果

3 讨论

3.1 参照物的选取

现代化学成分及药理试验表明，刺五加糖苷类是刺五加的主要活性成分之一，故选定紫丁香苷作为参照物。

3.2 刺五加粉碎度的确定

试验中考察了3种粉碎粒度即粗粉、细粉和超细粉，依法操作，所得图谱一致，本试验中选用细粉。

3.3 色谱条件的选择

流动相：本试验中比较了不同比例甲醇－水、乙腈 －水、甲醇 －0.1%冰醋酸、乙腈－0.1%冰醋酸4种溶剂系统进行梯度洗脱，结果以乙腈－水溶剂系统所得图谱的峰形较好、分离度大，故选用乙腈－水系统为本试验流动相系统。

色谱柱：本试验中考察了3种不同色谱柱，即Shimadzu VP －ODS 柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm），Agilent HC －C18(2)柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm），Phenomenex Luna C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm），进行梯度洗脱。结果表明，Agilent HC －C18(2)柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）色谱柱的基线最平稳，峰数最多，且分离度最好，因此最终选择 Agilent HC －C18(2)柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）为本研究的色谱柱。

测定波长：试验对比了 210，250，270，320 nm 波长的色谱图，结果发现，在210 nm波长处测定的色谱图出峰较多，反映的信息量较完全，故采用210 nm作为检测波长。

3.4 方法评价

本试验中将10批刺五加的指纹图谱导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版”。结果表明，10批刺五加药材的相似度均大于0.9，相似度较好。本试验中共用了10批药材，保证了样本量及试验方法的代表性，故可通过本方法制订标准指纹图谱来控制刺五加的药材质量。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[M].北京：中国医药科技出版社，2015：206－207.

[2]中国医学科学院药物研究所.中药志[M].北京：人民卫生出版社，1993：25－30.

[3]吴立军，郑 健，姜宝虹，等.刺五加茎叶化学成分[J].药学学报，1999，34（4）：294 － 296.

[4]潘海峰，孟艳彬，缪 红.刺五加的研究概况[J].承德医学院学报，2002，19（2）：157 －159.

[5]郑日男，金海艳，裴风郁.刺五加对胃缺血再灌注损伤防护作用的实验研究[J].中国中西医结合脾胃杂志，1998，6（4）：226－228.

[6]张敬一，杨惠敏，付琳杰，等.刺五加多糖对小鼠Lewis肺癌的实验性干预作用研究[J].癌变 畸变 突变，2001，13（4）：270.

[7]黄力平，许豪文，曲 镭，等.维生素E和复方刺五加液对小白鼠疲劳性游泳运动的作用[J].中华物理医学杂志，1998，20（2）：84.

[8]王荣光，王霞文.五味子和刺五加抗衰老作用探讨[J].中药药理与临床，1991，7（6）：31.

HPLC Fingerprint of Acanthopanax Senticosus from Different Habitats

Luo Xu，Tang Xiaolong，Yang Songqi，Chen Haiyan，Ke Xiao
（Sichuan Jishengtang Pharmaceutical Co.Ltd.，Chengdu，Sichuan，China 611930）

Objective To establish the HPLC fingerprint of Acanthopanax senticosus.Methods The chromatographic column was Agilent HC － C18（2） column （250 mm × 4.6 mm，5 μm），the mobile phase was acetonitrile－ water （gradient elution），the detection wavelength was 210 nm，the column temperature was 35 ℃ ，the flow rate was 1.0 mL ／s and the analysis time was 60 min.Results Fourteen chromatographic peaks were identified in the chromatogram of Acanthopanax senticosus，and the similarity of the fingerprints of the 10 batches of Acanthopanax senticosus was determined by fingerprint similarity software was in the range of 0.90 － 1.00.Conclusion The method is accurate and reproducible，which can provide a strong basis for the quality control of Acanthopanax senticosus.

Acanthopanax senticosus；HPLC；fingerprint；similarity

R284.1；R282.71

A

1006－4931(2017)20－0006－03

10.3969 ／j.issn.1006 － 4931.2017.20.002

四川省重大产业技术创新专项[2012CD00082]；四川科技成果转化项目[2012SC0029]。

罗旭（1980－），男，大学本科，高级工程师，研究方向为中药质量标准，（电话）028－64287669（电子信箱）014449＠cnkh.com。

柯潇（1983－），男，硕士研究生，高级工程师，研究方向为中药新药，（电子信箱）Txzz＠cnkh.com。

2017－05－23)