荷叶水提物对实验性肥胖大鼠脂代谢的影响及机制*

李毛毛, 黄鑫源, 梁乾坤， 李云霞， 剡 媛， 田志峰， 邱小青， 张晓文，宋 清， 李红芳,5△

(1. 兰州大学第一临床医学院, 2. 基础医学院生理学教研室， 3. 基础医学院机能实验室， 甘肃 兰州 730000；4. 广州市体育科学研究所， 广东 广州 510000； 5. 甘肃省新药临床前研究重点实验室， 兰州 730000)

荷叶水提物对实验性肥胖大鼠脂代谢的影响及机制*

李毛毛1, 黄鑫源1, 梁乾坤2， 李云霞2， 剡 媛2， 田志峰3， 邱小青3， 张晓文4，宋 清4， 李红芳2,5△

(1. 兰州大学第一临床医学院, 2. 基础医学院生理学教研室， 3. 基础医学院机能实验室， 甘肃 兰州 730000；4. 广州市体育科学研究所， 广东 广州 510000； 5. 甘肃省新药临床前研究重点实验室， 兰州 730000)

目的探讨荷叶水提物的减肥降脂作用及机制。方法通过离体脂肪组织灌流实验观察荷叶水提物对正常SD大鼠离体脂肪组织游离脂肪酸(FFA)释放的影响；利用高糖高脂饮食诱导建立实验性肥胖大鼠模型，探讨荷叶水提物给药4周后，大鼠体重和血脂水平的变化，并采用RT-PCR和免疫组化技术对脂肪组织过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPAR-γ)和瘦素(leptin)表达进行检测。结果离体实验发现荷叶水提物可明显促进离体脂肪组织FFA的释放。在体实验发现中剂量荷叶(60 mg/kg)与奥利斯他相似，可使实验性肥胖大鼠体重、血脂水平明显下降(P<0.05)，使脂肪组织PPAR-γ和瘦素的表达明显下降(P<0.05)。结论荷叶水提物可通过改善大鼠脂肪组织PPAR-γ和leptin的表达，促进脂肪的动员和分解，降低肥胖大鼠体重和血脂水平，有望研发为减肥药物。

荷叶水提物；大鼠；肥胖；PPAR-γ；瘦素

肥胖已经成为危害全球人类健康的疾病之一。肥胖人群患糖尿病、冠心病、肾功能衰竭等疾病的风险急剧增加[1，2]。荷叶为睡莲科植物莲的叶，又名莲叶、藕叶，在我国南北方均有种植，是我国传统的

中药材之一。荷叶是一种既可食用又可药用的降脂减肥天然植物。国内外对荷叶的药理药效研究表明：荷叶具有调脂减肥、抗氧化、抑菌、降压和保护血管内皮等的功能[3，4]，但其减肥降脂作用机制还不十分清楚。本实验旨在研究荷叶水提物对实验性肥胖大鼠体重和脂代谢水平的影响，并检测脂肪组织游离脂肪酸(free fatty acids,FFA)的释放和脂肪组织中过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma,PPAR-γ)和瘦素(leptin)表达的变化，以期探讨荷叶改善脂代谢的分子机制，为进一步指导实践和减肥降脂药的研发提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 荷叶提取物制备

将荷叶粉碎后，采用水提法进行提取，提取条件为：料水比例1∶10，加热温度80℃，提取时间2 h。提取后过滤，将提取液浓缩，喷雾干燥，得到荷叶水取物。

1.2 实验试剂

去脂肪酸小牛血清白蛋白(MP Biomedicals New Zealand Limited)； 盐酸肾上腺素(上海乔丰制药有限公司)；奥利斯他(浙江海正药业股份有限公司)；SP 免疫组化试剂盒购(北京中杉金桥公司)；Trizol (Invitrogen 公司；反转录试剂盒(Promega)；PPAR-γ抗体(affinity Biosciences公司)；leptin 抗体(Immunoway 公司)；Leptin和PPAR-γ的引物是由生工生工生物工程股份有限公司设计。

1.3 离体实验

健康成年SD大鼠,体重(250±20)g,将大鼠脱臼处死,迅速剪取腹膜后脂肪组织块，每份(300±5.0)mg， 放入 37℃的含有 0.04 g/ml 去脂肪酸小牛血清白蛋白的 Krebs 液中温育。温育液中可分别加入不同浓度的荷叶水提物及不同的阻断剂， 加入的药物容量均为600 μl。温育过程中持续通入 95%的O2和5%CO2的混合气体。90 min 后,吸取温育液用一次提取比色法测定 FFA的含量[5]。实验共分为 5组(n=8):(1)正常对照组(0.9% NaCl)；(2)盐酸肾上腺素组(10-6mol/L)；(3)荷叶水提物低剂量组(0.003 mg/ml)；(4)荷叶水提物中剂量组(0.01 mg/ml)；(5)荷叶水提物高剂量组(0.02 mg/ml)。

1.4 肥胖大鼠模型的建立及分组

4周龄健康SD大鼠(SPF级),体重(70±10)g, 由兰州大学实验动物中心提供，适应性喂养1周后, 按体重随机分为 2 组, 对照组：喂饲普通基础饲料；模型组：喂饲高脂饲料。高脂饲料含基础饲料38.5%，精炼猪油25.6%，蛋黄粉25.6%和蔗糖10.3%。每天配制1次。实验期间大鼠自由饮水、摄食, 每周称体重1次并记录。 第8周末, 以模型组大鼠的体重超过对照组体重20%的作为肥胖大鼠标准，随机将肥胖大鼠分为荷叶水提物低剂量组(20 mg/kg,n=7)；荷叶水提物中剂量组(60 mg/kg,n=7)；荷叶水提物高剂量组(180 mg/kg,n=7)；奥利斯他组(48 mg/kg,n=6)；模型组(n=6)和正常对照组(n=6)。将荷叶水提物和奥利斯他均用生理盐水配置为2ml的混悬液灌胃，每天给药2次，共给药4周。模型组及正常对照组均以等量生理盐水灌胃。给药期间对照组继续饲普通基础饲料，其余组给予高脂饲料喂养。

1.5 标本采集

给药4周后，禁食24 h，自由饮水，股动脉采血，室温静置1～2 h后，在 4℃条件下离心以 3 500～4 000 r/min 转速离心 10 min，取上层清液即血清，分装于离心管中，送至兰州大学第一医院检验科测定血中总胆固醇(total cholestrol，TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL)和高密度脂蛋白(high density lipoprotein,HDL)含量。取大鼠下丘脑组织和腹膜后脂肪组织用5%的福尔马林溶液固定。取100 g左右大鼠下丘脑组织和脂肪组织用液氮速冻后，存放在80℃冰箱中。

1.6 RT-PCR方法

取大鼠脂肪组织进行总mRNA的提取，将mRNA进行逆转录反应合成cDNA，将cDNA样品稀释5倍，采用promega 试剂盒进行PCR扩增，将扩增产物经2%琼脂糖凝胶进行电泳，拍照，利用Image J 软件分析条带的灰度值，计算相对含量。反应条件为：预变性95℃ 2 min,95℃变性5 s，leptin为58℃退火30 s,扩增38个循环和PPAR-γ为60℃退火30 s,扩增36个循环,结束时采集荧光信号。β-actin作为内参引物序列：上游TCCTGTGGCATCCATGAAACT，下游GAAGCACTTGCGGTGCACGAT；PPAR-γ引物序列：上游CATGCTTGTGAAGGATGCAAG，下游TTCTGAAACCGACAGTACTGACAT；leptin引物序列：TTGTCACCAGGATCAATGACATTT，下游GACAAACTCAGAATGGGGTGAAG。

1.7 免疫组化法

将下丘脑和脂肪组织的石蜡切片脱蜡和水化，PBS液冲洗5 min×3次后，3%过氧化氢溶液室温孵育10 min，PBS液冲洗5 min×3次， 滴加山羊血清封闭，室温30 min后滴加一抗(PPAR-γ为1∶200，leptin为1∶200)，4℃过夜，PBS液冲洗5 min×3次,滴加二抗,室温孵育10 min，再以DAB显色15 min，苏木素复染，脱水封片。免疫组化实验共设7组，除上述 6 组外增加一组阴性对照组(即用 PBS 替代一抗孵育)。

1.8 统计方法

采用 SPSS 19.0 软件进行分析，组间比较采用单因素变量的方差分析。

2 结果

2.1荷叶水提物对正常大鼠离体脂肪组织游离脂肪酸释放的影响

与正常对照组比较，盐酸肾上腺素可明显促进离体脂肪组织释放 FFA，低浓度水提物荷叶对脂肪组织释放 FFA 无明显的促进作用。中、高浓度的荷叶水提物可明显促进离体脂肪组织释放FFA(P<0.01，表1)。

GroupFFACon105.53±27.86E561.48±28.98**LLL130.53±17.21LLM388.32±39.66**LLH475.38±18.57**

FFA: Free fatty acids; Con: Blank group; E: Epinephrine group; LLL: Low-concentration group of lotus leaves: LLM：Medium-concentration group of lotus leaves；LLH：High-concentration group of lotus leaves

**P<0.01vsCon group

2.2荷叶对实验性肥胖大鼠体重和血脂水平的影响

给药后4周，奥利司他组、中剂量组和高剂量组体重均显著下降(P<0.05,P<0.01，表2)。中剂量组和高剂量组TC、TG、LDL-C水平明显下降，差异具有统计学意义(P<0.05，表3)。中剂量组和高剂量组HDL-C水平升高，差异具有统计学意义(P<0.05，表3)。

2.3荷叶水提物对实验性肥胖大鼠脂肪组织瘦素表达影响

RT-PCR结果显示,奥利司他组、低剂量、中剂量和高剂量荷叶水提物组脂肪组织leptin的mRNA的表达均显著下降(P<0.01)。中剂量组leptin的mRNA的表达低于奥利司他组，差异具有统计学意义(P<0.05，图1)。

免疫组化结果显示，奥利司他组、低剂量组、中剂量组和高剂量组荷叶水提物下丘脑组织leptin表达均下调(图2)。

Tab. 2 Changes of rat weight after treated with water extract of lotus leaves(g, ±s)

Con： Blank group； M： Model group； Orl： Orlistat group； LLL： Low-concentration group of lotus leaves； LLM： Medium- concentration group of lotus leaves ； LLH： High-concentration group of lotus leaves

*P<0.05,**P<0.01vsCon group；#P<0.05,##P<0.01vsM group

Tab. 3 Changes of rat blood lipids after treated with water extract of lotus leaves(g, ±s)

Con: Blank group; M: Model group; Orl: Orlistat group; LLL: Low-concentration group of lotus leaves; LLM： Medium-concentration group of lotus leaves; LLH: High-concentration group of lotus leaves; TC: Total cholestrol; TG: Triglyceride; HDL: High density lipoprotein; LDL: Low density lipoprotein

*P<0.05,**P<0.01vsCon group;#P<0.05,##P<0.01vsM group

2.4荷叶水提物对实验性肥胖大鼠PPAR-γ表达影响

RT-PCR结果显示,奥利司他组和中剂量组脂肪组织PPAR-γ的mRNA的表达均下调(P<0.05,图3)。

免疫组化结果显示，PPAR-γ主要在脂肪组织细胞核和细胞膜表达，且在各组中均有表达，其中模型组较空白组表达上调，而奥利司他组、中剂量组表达均下调(图2)。

3 讨论

脂肪被脂肪酶水解为游离脂肪酸(FFA)及甘油并释放入血液，继续被其他组织氧化利用，该过程称为脂肪动员。在禁食、饥饿等状态下，肾上腺素、去甲肾上腺素等分泌增加，激活脂肪酶，促进脂肪动员。β3肾上腺素受体主要分布于脂肪组织中, β3肾上腺素特异性的激活导致FFA快速大量的释放，对脂肪组织形态和代谢有很大的影响，从而促进脂肪动员，起到减肥的作用[6]。本实验发现荷叶水提物与肾上腺素相似可促进离体脂肪组织释放FFA，从而可促进脂肪动员，可能具有一定的减肥降脂作用。

Con： Blank group； M： Model group； Orl： Orlistat group； LLL: Low-concentration group of lotus leaves; LLM： Medium-concentration group of lotus leaves; LLH: High-concentration group of lotus leaves

**P<0.01vsCon group；##P<0.001vsM group；△P<0.05vsOrli group

本研究通过给实验性肥胖大鼠灌服荷叶水提物4周，肥胖大鼠的血脂水平和体重均有显著下降，说明荷叶水提物具有减肥的作用。

瘦素(leptin)主要由脂肪细胞分泌,同时胎盘、下丘脑和胃也可分泌瘦素，瘦素不仅在调节机体摄食和能量代谢中发挥重要作用，在神经内分泌、血管新生、生殖、免疫调节、创伤修复、糖尿病、心血管疾病和缺血再灌注损伤等方面也发挥着重要的作用[7]。陈愉等人研究表明，leptin表达水平可以作为实验研究中衡量大鼠肥胖程度的一种比较稳定可靠的指标[8]。因此，leptin在脂肪细胞中表达水平可作为衡量大鼠体内脂肪组织含量的指标。实验结果表明,中、高剂量荷叶水提物均可使脂肪细胞leptin蛋白表达下调和leptin的mRNA水平下降，证明灌服荷叶后肥胖大鼠体内脂肪组织减少。

Fig.2Expression levels of leptin in hypothalamus and PPAR-γ in adipose tissue(n=3)

N: Negative group； Con： Blank group； M： Model group； Orl： Orlistat group； LLL: Low-concentration group of lotus leaves; LLM： Medium-concentration group of lotus leaves; LLH: High-concentration group of lotus leaves； PPAR-γ： Peroxisome pro liferator-activated receptor gamma

Con： Blank group； M： Model group； Orl： Orlistat group； LLL: Low-concentration group of lotus leaves; LLM： Medium-concentration group of lotus leaves; LLH: High-concentration group of lotus leaves

**P<0.001vsCon group；##P<0.001vsM group;△P<0.05vsOrl group

肥胖主要是由于脂肪堆积，白色脂肪形成受多种因素调控，其中与过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPAR-γ)和转录因子CCAAT/增强子结合蛋白-α(C/EBPα)关系最为密切[9]。PPAR-γ在脂肪组织中大量表达，PPAR-γ在脂肪细胞分化、成熟以及对胰岛素的敏感性功能中起到关键作用, 其表达与脂肪细胞调节能量代谢和能量平衡有关。脂肪细胞中PPAR-γ被激活后,可诱导大脂肪细胞凋亡，皮下脂肪内的前脂肪细胞分化为成熟的脂肪细胞，小脂肪细胞数目增加,同时可使脂质合成及甘油三酯沉积有关的关键基因表达上调，从而促进脂肪堆积，导致肥胖，起到影响大鼠脂代谢的功能。当机体处于饥饿状态时，腺苷酸环化酶(AMPK)被激活，AMPK调节葡萄糖吸收和脂肪酸代谢,以及合成和氧化脂肪酸、胆固醇、糖原和蛋白质。激活AMPK减少脂肪合成主要通过磷酸化PPAR-γ和下调PPAR-γ的mRNA表达来完成。在体内PPAR-γ被内源性或外源性配体激活，例如前列腺素和罗格列酮，从而促进脂联素的表达和改善胰岛素抵抗，因此在临床上广泛用于糖尿病的治疗。然而这也增加了患者肥胖、心血管疾病、水肿和骨质疏松的风险[10]。本实验结果表明，中剂量荷叶水提物可使实验性肥胖大鼠脂肪组织PPAR-γ的表达下调和PPAR-γ的mRNA水平下降。

综述所述，荷叶具有降脂减肥的功效。其作用机制可能与其作用于肾上腺素受体和PPAR-γ以及调节瘦素表达有关。

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Effectsandmechanismsoflotusleafwaterextractonlipidmetabolism
ofadultexperimentalobesityrats

LI Mao-mao1, HUANG Xin-yuan1, LIANG Qiang-kun2, LI Yun-xia2, YAN Yuan2, TIAN Zhi-feng3,QIU Xiao-qing3, ZHANG Xiao-wen4, SONG Qing4, LI Hong-fang2,5△

(1. The First Clinical Medical College of Lanzhou University, 2. Departmemt of Physiology, College of Basic Medicine,3. Functional Laboratory of Medicine, Lanzhou 730000; 4. Guangzhou Institute of Sports Science, Guangzhou 510000;5. Key Laboratory of Preclinical Study for New Traditional Chinese Medicine of Gansu Province, Lanzhou 730000, China)

Objective: To investigate the lipid metabolic effect and mechanism of water extract of lotus leaves(Traditional Chinese Medicine).MethodsIsolated SD rat lipid tissues were suspended in organ baths containing Krebs solution, and the effect of lotus leaf water extract on free fatty acids (FFA) release was observed; The experimental obesity rat model was established by feeding them high glucose and fat diets, then the changes of body weight and blood lipid were measured in the model rats after intragastric administration with water extract of lotus leaves for four weeks, and the expressions of peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPAR-γ) and leptin were examined by RT-PCR and immunohistochemical.ResultsThe ex vivo experiment showed that water extract of lotus leaves effectively promoted the FFA release from isolated lipid tissues. In vivo experiment, similarly to Orlistat, water extract of lotus leaves(60 mg/kg)markedly decreased the body weight and blood lipid of experimental obesity rats(P<0.05), and obviously reduced the expressions of PPAR-γ and leptin(P<0.05).ConclusionWater extract of lotus leaves greatly improves the expression of PPAR-γ and leptin, which can promote the lipid mobilization and dissolution, reduce the body weight and blood lipid of adult rats with experimental obesity, therefore is expected to be developed into lipid-lowering diet pills.

water extract of the lotus leaf; rats; obesity; PPAR-γ; leptin

R335

A

1000-6834(2017)05-476-05

10.12047/j.cjap.5409.2017.114

教育部大学生创新创业项目(2014)；甘肃省中医药管理局科研项目(GZK-2015-23)；广州市体育科学研究合作项目(2013)

2016-01-08

2017-07-12

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Tel： 0931-8915092； E-mail: lihf@lzu.edu.cn