苏格木勒-3汤对异丙肾上腺素诱导的大鼠心肌肥厚后Caspase3/9表达的影响*

王 羽， 刘明洁， 付 瑶， 郭 欣， 于丽君

(内蒙古民族大学， 通辽 028000)

苏格木勒-3汤对异丙肾上腺素诱导的大鼠心肌肥厚后Caspase3/9表达的影响*

王 羽， 刘明洁， 付 瑶， 郭 欣， 于丽君△

(内蒙古民族大学， 通辽 028000)

目的探讨苏格木勒-3汤(SD-3)对异丙肾上腺素(ISO)所致大鼠心肌肥厚的保护作用并探讨其机制。方法32只Wistar大鼠随机分为空白对照组、模型组、SD-3治疗组和SD-3对照组(n=8)。模型组和SD-3治疗组皮下注射85 mg/(kg·d)ISO连续2 d致大鼠心肌肥厚模型；造模后，SD-3治疗组和SD-3对照组灌胃给予2 g/kg的 SD-3，空白对照组、模型组灌以等体积的蒸馏水， 干预14 d。于16 d末，观察各组大鼠心脏外观、心脏指数形态学变化；检测Caspase-3/9的活性和表达情况。结果与正常对照组相比，模型组心脏变大，缺血，心脏指数升高，病理损伤严重，SD-3汤改善上述现象。进一步发现SD-3汤降低因ISO诱导的Caspase-3/9的活性并下调Caspase-3/9的表达。SD-3组大鼠心脏没有变化，与空白对照组无明显差异。结论SD-3对ISO诱导的大鼠心肌肥厚具有保护作用，并通过下调Caspase-3/9表达缓解心肌肥厚转为心衰。

心肌肥厚；苏格木勒-3；异丙肾上腺素；Caspase-3/9；大鼠

cardiac hypertrophy; sugemule-3 decoction; isoproterenol; caspase-3/9; rat

病理性心肌肥厚是指在多种病理性刺激下，心脏通过增加心室壁厚度来代偿性增加心室壁的张力，继续刺激加剧心肌的应激反应，最终导致心肌细胞损伤、凋亡及坏死，进而抑制心功能，导致不可逆的心功能下降、心力衰竭[1-3]。2016年欧洲心脏病协会指出心肌肥厚合并有心力衰竭的药物包括血管紧张素转化酶抑制剂(angiotension converting enzyme inhibitors, ACEI)，血管紧张素Ⅱ受体阻断剂(angiotensin Ⅱ receptor blocker, ARB)，β受体阻滞剂，醛固酮受体拮抗剂，血管紧张素受体-脑啡肽酶抑制剂(angiotensin receptor-neprilysin inhibitor, ARNI)，这些药物可改善患者临床症状和心脏功能，不能治愈或完全阻止疾病发展[4]。现阶段，病理性心肌肥厚的发生发展机制仍未完全阐明，尚缺乏行之有效的干预手段。

蒙药苏格木勒-3汤(Mongolian drug sugemule-3 decoction, SD-3)是蒙医传统药方，临床应用多年。君药豆蔻味辛，性温、腻，为抑赫依之主药；臣药白苣胜子味微甘，性平，乃抑赫依；佐药荜茇味辛，性温、腻，调节体素。3药合用，相互协调，为赫依病之专方，尤其对心赫依病效果更佳[5]，但其作用机制不明。本研究利用ISO诱发大鼠心肌肥厚并用SD-3干预，观察其对大鼠心肌肥厚组织学及Caspase活性的影响，旨在探讨SD-3的治疗机制，为SD-3临床应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂

SD-3经蒸馏水沸水浸泡密封过夜后，四层纱布过滤除去沉渣得上清液，每毫升上清液中含0.2 g生药，将其保存在4℃冰箱。异丙肾上腺素(isoprenaline, ISO)购自美国Sigma公司；戊巴比妥钠购自德国Merck公司。

1.2 动物

Wistar健康雄性SPF级大鼠32只，体重约200～220 g，由长春亿斯公司提供。全部大鼠普通饲料喂养，饲养条件为标准温度为20℃～22℃及相对湿度为50%～60%的清洁、通风较好的动物室中，分笼饲养，8只/笼，笼子足够大鼠自由活动，同样可自由饮水进食，平均12 h的自然昼夜条件。

1.3 动物分组及模型建立

Wistar大鼠适应性饲养一周后，称重后随机分成4组(n=8)：空白对照组(sc生理盐水2 d +ig蒸馏水14 d)、模型组(sc大剂量ISO 2 d +ig蒸馏水14 d)、苏格木勒-3汤治疗组(sc大剂量ISO 2 days +ig SD 14 d)，苏格木勒-3汤组(sc生理盐水2 d +ig SD 14 d)。肥厚模型组、苏格木勒-3汤治疗组大鼠在实验开始第1、2天颈背部皮下注射(sc)大剂量ISO溶液85 mg/(kg·d)，制作心肌肥厚模型；空白对照组及苏格木勒-3汤组大鼠，在其颈背部皮下注射同等量生理盐水。皮下注射ISO或生理盐水2 d后，苏格木勒-3汤组及苏格木勒-3汤治疗组进行灌胃(ig)药物处理(根据临床用药剂量设定为2 g/kg)，空白对照组及肥厚模型组灌以等体积的蒸馏水，1次/天连续灌胃14 d。

1.4 病理观察

大鼠最后一次给药，禁食不禁水14 h后，称取体重，按45 mg/kg剂量腹腔注射(ip)2% 戊巴比妥钠。麻醉后，取心脏，用0.9%氯化钠溶液清洗心脏组织及血迹，观察心脏形态变化。称取各组大鼠心脏重量，心脏肥厚程度以心脏重量指数(heart weight/body weight, HW/BW)表示。截取心尖部分，置4%中性多聚甲醛溶液中固定，24 h后常规石蜡包埋，切片行苏木精-伊红(HE)染色，置于镜下观察大鼠心肌组织病理学改变。

1.5 分光光度法检测心肌组织匀浆中Caspase酶的含量

取新鲜大鼠心脏组织，剪成小块后超声粉碎器制备心脏组织匀浆，4℃，12 000 r/min离心10 min后弃沉淀，上清保存于-20℃备用。采用Caspase-3/9活性检测试剂盒(碧云天)检测心脏组织中Caspase-3/9活性。具体步骤操作参照试剂盒说明书进行，酶标仪测定其OD值。

1.6荧光定量PCR检测各组大鼠心肌组织中Caspase-3/9基因表达

取新鲜心脏组织，采用天根动物组织总RNA提取试剂盒提取心脏组织总RNA。测定紫外分光光度计260、280处OD值，OD260/280在1.7～2.1为可用范围。总RNA浓度(ng/μl)= (OD260)×(稀释倍数n)×40。提取的总RNA稀释后进行合成cDNA模板，并以此为模板进行Caspase-3/9扩增。

反应体系的配制：2×SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(Tli RnaseH Plus) 10 μl；PCR Forward、Reverse Primer(10 μmol/L) 0.6 μl；ROX Reference Dye(50×) 0.4 μl；template 2 μl；ddH2O2(sterile distilled water) 至20 μl。

反应条件：预变性95℃ 15 min；PCR反应 95℃ 10 s，60℃ 31 s，40个循环经荧光定量PCR获得各个目的基因的Ct值。反应结束后，按照2-△△Ct法计算结果。Caspase-3的引物序列(CAS3F: 5’-GGA GCA GTT TTG TGT GTG TGA T-3’，CAS3R: 5’-GAA GAG TTT CGG CTT TCC AGT-3’)；Caspase-9的引物序列(CAS9F: 5’-CTG CGA ACT AAC AGG CAA GC -3’，CAS9R: 5’-CTA GAT ATG GCG TCC AGC TG-3’)；β-actin的引物序列(BF: 5’-GTG GGG CGC CCC AGG CAC CA -3’，BR: 5’-CTC CTT AAT GTC ACG CAC GATT -3’)。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1SD-3对ISO诱导心肌肥厚大鼠心脏外观及心脏指数的影响

与模型组相较，SD-3治疗组明显抑制心肌肥厚，而仅灌胃SD-3的大鼠心脏与空白对照组无明显差异(图1)，模型组大鼠HW/BW明显高于空白对照组[0.00343±0.00056vs0.00217±0.00017,P<0.05]，SD-3显著降低ISO诱导的HW/BW增加[0.00295±0.0002,P<0.05vsISO]；SD-3组与空白对照组相比，HW/BW无显著差异(图2)。

2.2SD-3对ISO诱导心肌肥厚大鼠的心肌组织病理学改变的影响

各组心肌组织病理学改变(图3)，空白对照组心肌组织细胞完整，结构正常，界限清晰而模型组大鼠心肌组织细胞崩解坏死，细胞排列紊乱，界限不清，细胞核散在，呈弥漫性坏死，胞浆混浊，细胞核散在于细胞之间；SD-3处理后该现象有所缓解。SD-3组大鼠心肌组织与空白对照组相比无明显变化。

Fig.1Cardiac morphology of heart in each group

A: Control group; B: Model group; C: Mongolian sugemule-3+model group; D: Sugemule-3 group

HW: Heart weight; BW: Body weight; A: Control group; B: Model group; C: Mongolian SD-3+model group; D: SD-3 group

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsmodel

Fig.3Pathological changes of myocardial tissue in rats (HE staining ×400)

A: Control group; B: Model group; C: Mongolian sugemule-3+model group; D: Sugemule-3 group

2.3SD-3对ISO诱导心肌肥厚大鼠Caspase-3/9活性和表达的影响

与空白对照组相比较，模型组中Caspase-3/9的活性显著升高。而SD-3处理后的大鼠心脏Caspase-3/9的活性明显降低。仅用SD-3处理的大鼠心脏组织Caspase-3/9的活性与空白对照组心脏无明显差异(表1)。

每组分别取8个样本，每个样品做3孔。如表1所示，ISO处理组Caspase-3/9 mRNA 的表达较空白对照组显著升高(P<0.01)，而SD-3处理后Caspase-3/9 mRNA 的表达显著下降(P<0.01)。

3 讨论

心血管疾病是当今人类面临的亟待解决的疾病之一，而心肌肥厚是心血管相关疾病的共同病理转归[6]。蒙医中根据心血管疾病临床症状归纳为心赫依病。心为病变赫依主要串行之道，故临床上心病属赫依性者常见。在《四部医典》中：“治心、主脉、大肠之病，应以抑赫依为主”。本病主要由于赫依失衡后串行心脏，与巴达干相搏，影响希拉。导致心脏功能紊乱，遂成此病。治宜以镇赫依，安心为原则[7]。而赫依病的专方即为SD-3。SD-3蒙医传统药方，临床已应用多年，在蒙医经典著作《四部医典》，《中国百科全书·蒙医学》，《蒙医方剂学》(统编教材)中均有记载。该方中君药白豆蔻(蒙古语音译名为查干苏格木勒)味辛，性温、腻、锐、轻、燥，为抑赫依之主药；佐药荜茇味辛，性温、腻、锐、轻、燥，具有助胃火，祛巴达干赫依，调和体素，壮阳，平喘，祛痰，止痛功能。豆蔻，白苣胜子，荜茇3药合用，相互协调，为赫依病之专方，尤其对心赫依病效果更佳。研究证明苏格木勒-3汤为具有抑赫依，改善赫依血循环，镇痛等功能，是治疗心赫依病的有效蒙成药[8]。

Tab. 1 The activity and expression changes of Caspase-9/3 in each group(±s， n=8)

A: Control group; B: Model group; C: Mongolian sugemule-3+model group; D: Sugemule-3 group

**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsmodel

作为永久细胞，心肌细胞一般不发生增殖或增殖率极低。心肌肥厚引起心肌细胞凋亡现象主要是由于超负荷状态。心肌细胞凋亡是心肌肥厚向心衰转化的重要机制，抑制凋亡有望缓解心肌肥厚向心衰转变的发生。病理性心肌肥厚会激活死亡受体途径和线粒体途径进而促进凋亡的发生[9,10]。Caspase-3是凋亡的关键效应酶，其可以作用于多种底物导致蛋白降解引起细胞凋亡[11]。病理性心肌肥厚发生过程中，胞质中的procaspase-9被剪切为活性Caspase-9，启动Caspase级联反应，激活下游的Caspase-3引发凋亡[12]。本研究采用大剂量ISO诱导大鼠心肌肥厚模型，并用SD-3干预。结果表明SD-3可缓解ISO诱导的心肌肥厚，而正常大鼠给予SD-3后，大鼠心脏无明显改变，说明SD-3对大鼠心脏结构无影响，无毒性作用。进一步检测Caspase-3/9的活性和基因表达情况，结果表明SD-3治疗后，有效抑制Caspase-3/9的活性和表达，表明SD-3通过有效抑制caspase-3/9缓解心肌肥厚转为心衰。

综上所述，本研究初步证明蒙药苏格木勒-3汤可以有效缓解ISO诱发病理性心肌肥厚，并通过抑制caspase-3/9缓解心肌肥厚转为心衰。

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R331.3; R332

A

1000-6834(2017)05-390-04

10.12047/j.cjap.5532.2017.094

国家自然科学基金项目(81560590)；内蒙古自治区科技计划项目(KJJH1603)；内蒙古民族大学博士启动基金项目(BS345)

2016-11-28

2017-05-18

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Tel: 13947550088; E-mail: shen348@126.com