基因芯片技术在结核性脓胸治疗中的应用

2017-10-30天津医科大学300070韩东孙大强

首都食品与医药 2017年6期

天津医科大学（300070）韩东孙大强

中国结核病年发病患者高达130万，为世界第二大结核病发病国家，同时也是耐多药结核病的高发病区[1]。结核性脓胸作为常见的肺外结核病，患病者众多，病因多由结核性胸膜炎治疗不彻底发展形成，就诊时多已发展至包裹期，单纯抗结核药物或姑息引流治疗效果较差，需要手术治疗[2]。近年来，手术方式的进步使得患者治疗效果显著。但在临床工作中，部分患者在术后规范抗结核治疗的同时仍出现了复发甚至是反复多次复发的情况，林森林等[3]的研究发现在肺结核病复发患者中耐药率较高，结核性脓胸复发病例中可能同样存在较高的耐药率，但传统的细菌培养检测方法结核菌检出率低且耗时长，对于结核菌耐药性的确定以及抗结核方案的调整作用甚微。近年来出现的基因芯片技术通过直接检测结核菌DNA及耐利福平基因rpoB及耐异烟肼基因katG、inhA的突变位点，从而确定结核分枝杆菌及其耐药情况，具有准确、灵敏、快速的特点，对于结核分支杆菌的诊断以及耐药性的检测已被广泛认可[4]，本研究运用基因芯片技术对结核性脓胸患者的坏死物标本进行检测、分析并指导临床治疗，取得了良好的临床效果。

1 材料与方法

1.1 标本来源 2015年3月～2016年4月我院收治的结核性脓胸患者60例，术前HRZE抗结核方案治疗至少2周，术中彻底清理脓腔内病灶及增厚纤维板，术后病理证实均为结核性，并继续2HRZE/4HR方案抗结核治疗。其中男性37例，女性23例，年龄最小16岁，最大58岁，平均27岁，其中12例为复发病例（单次复发8例，多次复发4例），术中留取坏死物标本，使用基因芯片法进行检测。

1.2 实验仪器与方法检测仪器采用德国Hain GT B48，检测试剂为GenoType® MTBDRplus，试验以DNA.STRIP®技术为基础，对来自纯培养物或病人肺部等结核菌阳性标本的结核分枝杆菌复合群及其耐利福平和/或异烟肼耐药基因进行分子生物学检测。通过检测最有意义的rpoB基因突变（编码RNA聚合酶β-亚单位）确定对利福平的耐药性；检测katG基因（编码过氧化氢酶）确定对异烟肼的高水平耐药，而检测inhA基因的启动子区（编码NADH烯酰酸性磷酸酶还原酶）确定对异烟肼的低水平耐药。

2 结果

2.1 坏死物结核分枝杆菌菌种鉴定结果 60例标本中结核分枝杆菌阳性49例，阴性7例，结核分枝杆菌检出阳性率为81.6%，而其中12例复发患者的检测结果均为阳性，本组60例标本同时进行了抗酸染色涂片及基因芯片检测，抗酸染色法阳性9例，阴性51例，结核分枝杆菌检出阳性率15%，其中12例复发患者中阳性结果3例，阴性9例，对比结果见附表1和附表2。

2.2 结核分枝杆菌耐药基因结果对于结核分枝杆菌鉴定结果为阳性的病例，进一步进行耐药性的分子药敏检测，对本组中阳性病例共49例，其中包括复发病例12例，进行耐药基因检测，结果显示共发现耐药菌株8例，耐药率12.7%，而这8例耐药菌株均来自复发病例中，其中5株为对INH及RPF均耐药的多药耐药株，3株为对RFP耐药株。

附表1 基因芯片法和抗酸染色法检测结果比较

2.3 调整抗结核治疗方案疗效对于耐药基因检测阳性的8例复发病例，随机分为观察组及对照组各4例，观察组继续之前2HRZE/4HR抗结核方案，治疗组根据其耐药情况，参照相关指南[5]调整抗结核方案，对于耐INH病例调整抗结核方案为2REZ/7RE，对于耐RFP病例调整抗结核方案为3HZSE/15EHZ，对于耐INH、RFP病例调整抗结核方案为3THOEZAK/18THOE，并进行了6个月～1年的随访，随访期间观察组4例病例中，2例再次出现了复发，而治疗组4例病例中，未再出现复发的情况。

3 讨论

近年来结核病疫情仍呈现上升趋势，耐药结核病也是造成这一结果的主要原因之一，对于这种耐药结核病高发形势，我国及世界范围都在进行着相关的临床研究，也提出了多种针对不同耐药结核菌的抗结核方案及指南甚至个体化治疗方案，但治疗的前提需要细菌学及药敏结果的支持。由于结核分支杆菌培养对于培养环境的要求高，培养十分困难，总体阳性率低，而在各种标本中坏死物的培养阳性率相对更低，比较而言，痰液中的结核分枝杆菌数量要高于坏死物，培养阳性率高于坏死物[6]，故之前相关研究[7][8]多针对耐多药肺结核患者，研究结果表明治愈率虽然存在一定差异，但总体取得了一定的治疗效果，而针对于坏死物的结核分支杆菌培养报道较少，无法提供相应的细菌学依据，所以在结核性脓胸病例中无法及时确定结核分支杆菌的耐药情况，进行抗结核方案的调整及疗效的观察。

基因芯片技术近年来应用广泛，相关研究[9]通过对传统培养方法与基因芯片法进行对比显示其拥有较高的敏感性以及准确性，而且较传统培养方法所需时间明显缩短，结核分枝杆菌的鉴定需要6～7小时，耐药基因的检测需要7～8小时即可完成分析，因此在结核分枝杆菌的检测中应用越来越广泛，同时基因芯片方法可广泛用于多种标本的检测，包括痰液、脓汁、胸腹水、坏死物甚至尿液，刘申的研究显示坏死物的结核分枝杆菌检出阳性率位于各类标本前列，明显高于痰液等标本，而本研究中基因芯片法检测坏死物结核分枝杆菌阳性率高达86%，甚至高于其之前研究。这对结核性脓胸的耐药性分析提供了良好的依据，具有十分重要的意义。

通过对本研究的结果进行分析总结可以发现，全部60例患者均病理证实为结核性，基因芯片法检测结核分枝杆菌阳性率达到88.3%，准确性及灵敏性较高，对比抗酸染色法优势明显，12例复发患者均检测为阳性，进一步行耐药基因检测，共发现耐药菌株8例，并全部来源于复发病例中，其中3例为耐多药菌株，进一步通过对照观察，调整抗结核治疗方案的治疗组未再出现复发，而沿用之前抗结核方案的观察组中两例患者痊愈，而仍有两例患者再次出现复发情况。

结核病复发与多种因素有关，对于结核性脓胸而言，包括感染耐药结核分枝杆菌、服药不规律甚至手术清理不彻底等，本研究结果显示耐药基因阳性病例全部来自复发患者中，复发患者中耐药病例比例达到66.7%，说明耐药与复发关系紧密，这也与整体结核病复发患者中高耐药率情况相符。通过对照实验发现对于此类耐药患者，及时调整抗结核方案至关重要，治疗组4例患者根据结核药物耐药情况，及时根据指南调整了抗结核治疗方案，通过随访发现，4例患者恢复良好，均未在出现复发情况，而观察组仍出现了部分复发情况，可见对于耐药基因检测结果在抗结核治疗中起到了重要的指导意义。