Survivin基因调节人脑胶质瘤细胞侵袭与迁移机制的探讨

●刘翠芳

Survivin基因调节人脑胶质瘤细胞侵袭与迁移机制的探讨

●刘翠芳

目的：检测并研究Survivin基因对U251及U87神经胶质瘤细胞侵袭及迁移的影响，为胶质瘤的基因治疗提供理论和实验依据。方法：（1）通过划痕实验及Transwell迁移实验检测细胞在干扰及过表达Survivin胶质瘤细胞迁移的变化；（2）通过Transwell侵袭实验检测细胞在干扰及过表达Survivin胶质瘤细胞侵袭能力的变化；（3）通过Westernblot和免疫荧光实验检测细胞在干扰Survivin 48h后N-cadherin表达及定位的变化；（4）通过明胶酶谱实验检测在干扰及过表达Survivin 48h后细胞分泌MMP的变化。结果：（1）针对Survivin特异性的三条siRNAoligo，干扰效率达70%-80%；过表达后转染率在80%左右；（2）划痕实验Transwell实验（不铺胶）证实转染siRNAoligo和过表达Survivin后细胞迁移数目明显低于对照组(P＜0.01)，Transwell迁移实验证实转染siRNAoligo和过表达Survivin后穿过滤膜的细胞数目明显低于对照组(P＜0.01)；（3）Transwell侵袭实验证实转染siRNAoligo和过表达Survivin后细胞侵袭数目明显低于对照组(P＜0.01)；（4）明胶酶谱证实转染siRNAoligo后细胞分泌基质金属酶低于对照组，而过表达Survivin后高于对照组；明胶酶谱实验显示：与对照组相比，siRNAoligo组MMP2的活性明显降低（P＜0.05）。结论：（1）Survivin基因调节神经胶质瘤细胞的迁移能力；（2）Survivin基因通过调节MMP2的分泌来影响神经胶质瘤细胞的侵袭能力；

神经胶质瘤；Survivin；细胞迁移；细胞侵袭；基质金属酶

脑胶质瘤是临床最为常见的原发性颅内肿瘤，约占颅内肿瘤的46%，占成年人全身肿瘤的2%；恶性胶质瘤的发病率为5～8/100万。在世界范围内胶质瘤是中枢神经系统最常见、死亡率最高的原发性脑肿瘤之一[1]，是威胁人类生命健康最主要的疾病之一，约占全部原发性神经系统肿瘤40～60%，年发病率5～10/10万[2]。

1 资料与方法

1.1 一般资料

引物：质粒PG-survivin、PG由武汉晶赛生物公司合成并测序。

Survivin干扰序列为∶GGA CCA CCG CAT CTC TAC A。

β-actin：上游引物：5’-CTGGGACGACATGGAGAAAA-3’

下游引物：5’-AAGGAAGGCTGGAAGAGTGC-3’

针对人Survivin基因特异性的三条siRNAoligo：

1.2 方法

1.2.1 细胞转染(按Lipofectamine™2000说明书操作)

1.2.2 细胞划痕试验

1.2.3 细胞体外侵袭试验

1.2.4 细胞体外迁移试验

Transwell细胞培养小室的上室不铺设Matrigel胶，其余方法步骤同4。

1.2.5 明胶酶谱试验

1.3 统计学意义及作图软件

用于分析统计及作图软件为Image J、SPSS19.0、Adobe Illustrator CS4等，数据以均数±标准误（±s )表示，统计分析方法采用选用两样本 t检验和单因素方差分析(One-way ANOVA)， ⋆P＜0.05差异有统计学意义，⋆⋆ P＜0.01，有显著性差异。

2 结果

2.1 在U251细胞中Survivin干扰、过表达效果的检测

针对Survivin基因设计三条高特异性siRNA oligo，并请Genema公司合成，分别为Survivin-siRNA1、Survivin-siRNA2和Survivin-siRNA3。如图1

图1

2.2 转染小干扰及过表达Survivin基因对胶质瘤细胞系U251迁移能力的影响

为研究Survivin对细胞迁移的影响，首先采用划痕实验，如图1C所示，划痕48h后阴性对照组划痕已明显缩小，并且有融合的趋势，而转染小干扰组的划痕无明显愈合，也无融合趋势。如表1

表1 转染siRNA后不同时间段划痕实验细胞数与对照组的比值

2.3 Survivin基因对胶质瘤细胞系U251侵袭能力的影响

以上结果表明Survivin基因可增加胶质瘤细胞的迁移能力，那么FRK是否对胶质瘤细胞的侵袭能力产生影响？为此利用Transwell侵袭实验来进一步的探讨。结果示：与阴性对照相比，干扰组细胞侵袭数目明显减少；而与空载体组相比，过表达Survivin组细胞侵袭能力明显增加。如表2

表2 染siRNAoligo及过表达不同时间段后Transwell侵袭实验细胞数与对照组的比值

3 讨论

细胞迁移和侵袭是一个动态的过程，这个过程需要很多蛋白的调节。恶性肿瘤的发生和恶性进展是一个逐步积累、多基因改变的多步骤过程，恶性肿瘤常表现出细胞无限增殖、凋亡减少、细胞周期调控异常、大量新生血管形成、远处转移等特征，胶质瘤也表现出恶性肿瘤的常见特征。

结果显示：与阴性对照组相比，干扰组MMP2活性在转染48h时明显降低，而MMP9活性未检测出。提示在U251细胞中干扰Survivin基因，可以降低MMP2蛋白的活性，下调MMP2的分泌，进而抑制了其迁移与侵袭的能力。

（作者单位：滨州医学院免疫学教研室、东营市人民医院）

[1]Kleihues P, Louis DN, Scheithauer BW, et al.The WHO classification of tumors of the nervous system [J] .Neuropathol Exp Neurol, 2001.61∶215-225