芦荟中1个具有抗菌活性的多取代基萘类新化合物

孔维松+李晶+刘欣+米其利+陈建华+李雪梅+杨光宇+胡秋芬+李涛+杨叶昆

[摘要] 对库拉索芦荟的化学成分进行研究。运用硅胶、凝胶、MCI-gel 树脂及 RP-HPLC 等多种色谱技术从库拉索芦荟70%乙醇提取物中分离鉴定了1个多取代基萘类化合物，该化合物鉴定为3-羟基-1-（1，7-二羟基 -3，6-二甲氧基萘 -2-基）-1-丙酮 （1）。生物活性测试表明，其对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）菌株的MIC90为（48±4） mg·L-1，小于左氧氟沙星的MIC90（58±5） mg·L-1，具有突出的抗菌活性。

[关键词] 芦荟； 多取代基萘； 抗菌活性

[Abstract] A new naphthalene derivative has been isolated from Aloe vera by using various chromatographic techniques， including silica gel， sephadex， MCI-gel resin， and RP-HPLC. The new compound was determined as 3-hydroxy-1-（1，7-dihydroxy-3，6-dimethoxynaphthalen-2-yl）propan-1-one （1）. In the biological activity assay， compound 1 disglayed prominent antibacterial activity with a MIC90 value of （48±4） mg·L-1 for methicillin resistant Staphylococcus aureus （MRSA） strain which was stronger than that of the positive control levofloxacin with a MIC90 value （58±5） mg·L-1.

[Key words] Aloe vera； naphthalene derivative； antibacterial activity

芦荟为百合科芦荟属多年生常绿草本植物，原产于地中海、非洲，因其易于栽种，为花叶兼备的观赏植物，颇受大众喜爱。据考证野生芦荟品种有300多种，有药用价值的芦荟品种主要有：洋芦荟，库拉索芦荟，好望角芦荟，元江芦荟等。芦荟是集食用、药用、美容、观赏于一身植物^[1]。其泌出物（主要有效成分是芦荟素等葱醌类物质）已广泛应用到医药和日化中。芦荟酊是抗菌性很强的物质，能杀灭多种真菌、霉菌、细菌、病毒等病菌，抑制和消灭病原体的发育繁殖^[2]。研究表明芦荟中发现的化学成分已达160多种，其有效活性成分达 100 种以上。芦荟中主要活性成分有蒽醌、吡喃酮、色酮、萘类衍生物、多糖类、黄酮等，这些有效成分具有抗菌、抗炎、解热、保肝、抗癌、杀虫及免疫增强等多方面的功用^[3]。为了从芦荟中发现更多的活性化学成分，本实验对产自云南元江的库拉索芦荟Aloe vera （L.） Burm. f.进行了化学成分研究，并从中分离到1个新的多取代基萘类化合物，该化合物具有显著的抗菌活性。

1 材料

UV-2401A 紫外光谱仪 （日本岛津公司）；Bio-Rad FTS-185 傅里叶变换红外光谱仪 （美国伯乐BIO-RAD公司）；DRX-500 型核磁共振仪 （瑞士布鲁克公司）；API QSTAR 飞行时间质谱 （美国应用生物公司），VG Autospec-3000高分辨质谱 （英国质谱仪器公司），半制备 HPLC 分析仪器为岛津 LC-8A 型高效液相色谱仪，色谱柱为安捷伦公司 Zorbax PrepHT GF （21.2 mm×250 mm，7 μm） 和安捷伦 Zorbax C18 （9.4 mm×250 mm，5 μm）。柱色谱硅胶 （80～100，150～200 目）、GF254 （100 mm×100 mm） 硅胶板，均为青岛海洋化工厂生产；MCI 填充材料为 MCI-gel CHP-20P （75～150 μm），购于日本三棱公司；凝胶为 Sephadex LH-20，购于安玛西亚生物技术（上海）有限公司；薄层色谱法显色，显色剂为 5% H2SO4乙醇溶液，喷洒后适当加热即可；工业用二氯甲烷、甲醇、乙酸乙酯。

实验样品为库拉索芦荟，拉丁名A. vera，2016年 10 月采于云南元江县，取芦荟地上部分晒干供随后的提取和分离用。标本经云南民族大学民族医药学院杨青松教授鉴定，标本 （No.2016089） 保存于云南民族大学民族药资源化学重点实验室标本馆。

2 提取与分离

取干燥的芦荟样品2.5 kg 粉碎到30 目，然后用70% 乙醇水溶液提取 4 次，每次用量为 3.5 L，室温浸泡、超声 4次 （每次 30 min），滤过，合并提取液，提取物浓缩到小体积后用乙酸乙酯萃取，将乙酸乙酯相减压浓缩得浸膏26.8 g。浸膏用30 g 粗硅胶 （80～100 目） 拌样，烘干，用250 g硅胶 （150～200目） 柱色谱，二氯甲烷-丙酮 （20∶1，9∶1，8∶2，7∶3，6∶4，5∶5） 梯度洗脱，分成 6 个部分。将二氯甲烷-丙酮（7∶3）洗脱部分用甲醇溶解，采用 Agilent 公司的 Zorbax PrepHT GF （21.2 mm ×250 mm，7 μm） 反相柱，以48%甲醇水溶液为流动相，体积流量为20 mL·min-1，收集32.8 min 的色谱峰，得化合物粗品。粗品再以甲醇为流动相，用葡聚糖凝胶Sephadex LH-20 柱色谱净化可得化合物1的纯品25.8 mg（图1）。

3 结构鉴定

化合物1为橙红色胶状物，其高分辨质谱HR-ESI-MS （正离子采集） 显示准分子离子峰为 m/z 315.085 2[M+Na]+，（计算值315.084 5）。结合1H 和13C-NMR谱确定化合物分子式为C15H16O6，不饱和度为8。红外光谱中显示了羟基（3 425 cm-1）、羰基 （1 682 cm-1） 和芳环 （1 618，1 542，1 441 cm-1） 的共振吸收峰。紫外光谱在 215，260，332 nm 有最大吸收证实化合物中存在芳环结构。化合物的1H，13C-NMR和DEPT数据 （表1） 显示化合物中存在16个碳和16个氢，包括1个1，2，3，6，7-五取代的萘母核^[4] （C-1～C-8，C-4a和C-8a；H-4，H-5和H-8），1个3-羟基-1-丙酮基^[5] （C-1′～C-3′；H2-2′和H2-3′），2个甲氧基 （δC 56.0 q，56.3 q；δH 3.80 s，3.83 s），以及2个酚羟基 （δH 12.74，11.28）。1，2，3，6，7-四取代的萘母核可进一步由H-4和C-2、C-3、C-4a、C-8a、C-5，H-5和C-4、C-6、C-7、C-4a、C-8a，以及H-8和C-1、C-6、C-7、C-4a、C-8a的HMBC相关（图2）得到确认。进一步分析其HMBC相关谱，根据2个甲氧基氢 （δH 3.80，3.83） 分别与C-3 （δC 150.1） 和C-6 （δC 154.3）的HMBC相关可推测甲氧基取代在萘母核的C-3和C-6位。2个酚羟基取代在萘母核的C-1和C-7位可由酚羥基氢 （δH 12.74） 和C-1 （δC 167.3）、C-2 （δC 109.3）、C-8a （δC 121.6），以及另一个酚羟基氢 （δH 11.28） 和C-6 （δC 154.3）、C-7 （δC 148.3）、C-8 （δC 105.3）的HMBC相关得到确认。3-羟基-1-丙酮基取代在C-2位可通过H2-2′ （δH 3.33）和C-2 （δC 109.3）的HMBC相关得到确认。萘环上典型的质子信号H-4 （δH 6.43 s）、H-5 （δH 6.94 s）和H-8 （δH 7.62 s）也支持萘母核上的上述取代基模式。至此，化合物的结构得到确定，并命名为化合物命名为3-羟基-1-（1，7-二羟基-3，6-二甲氧基萘-2-基）-1-丙酮；英文名为3-hydroxy-1-（1，7-dihydroxy-3，6-dimethoxynaphthalen-2-yl）propan-1-one。

化合物1的红外、紫外和质谱数据UV （甲醇），λmax （log ε） 332 （3.55），260 （3.18），215 （3.82） nm；IR （溴化钾压片）：νmax 3 425，3 064，2 959，2 771，1 682，1 618，1 542，1 441，1 350，1 167，1 288，1 154，1 046，1 012 cm-1；1H和13C-NMR數据 （CDCl3，500 和125 MHz）（表1）；正离子模式 ESI-MS m/z 315 [M+Na]+；正离子模式HR-ESI-MS m/z 315.085 2 [M+Na]+ （C15H16NaO6，计算值315.084 5）。

4 体外抗菌活性检测

受试菌株为云南省第一人民医院分离于临床标本的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）菌株。苯唑西林耐药表型阳性（≥4 mg·L-1），且mecA基因检测阳性。采用美国临床与实验室标准协会（CLSI，clinicaland laboratory standards institute）推荐的微量肉汤稀释法进行药敏试验，操作规范参照CLSIM07-A9标准，判定标准参照CLSIM100-S24标准，具体方法如下：① 抗菌药物贮存液制备：制备抗菌药物贮备液的质量浓度为2 560 mg·L-1，溶解度低的抗菌药物可稍低于上述浓度。所需抗菌药物溶液量或粉剂量可公式进行计算。配制好的抗菌药物贮存液应贮存于-20 ℃以下环境，保存期不超过6个月。②待测菌的制备：用接种环挑取过夜培养的MH（A）培养皿上的单菌落于MH（B）培养基中，校准为0.5麦氏比浊标准，约含菌数1×108 CFU/mL，然后稀释100倍，即得到约含菌数1×106 CFU/mL的菌液，备用。③分别将抗菌药物贮备液母液（2 560 mg·L-1）稀释10倍，得到浓度为256 mg·L-1的抗菌药物溶液。取无菌的96孔板，第1孔加入200 μL的抗菌药物，第2～10孔分别加入100 μL的MH肉汤培养基，从第1孔吸取100 μL加入第2孔，混匀，再吸取100 μL至第3孔，依次类推，第10孔吸取100 μL弃去。此时各孔药物质量浓度依次为256，128，64，32，16，8，4，2，1，0.5 mg·L-1，第11孔加入200 μL菌液（阳性对照），第12孔加入200 μL MH（B）培养基（阴性对照）。④在1～10孔各加入50 μL之前备好的菌液，使每管最终菌液浓度约为5×105 CFU/mL，第1～11孔药物浓度分别为128，64，32，16，8，4，2，1，0.5，0.25 mg·L-1。将接种好的96孔板放置37 ℃培养箱进行培养，24 h观察菌液生长情况。同时用标准株做质控。⑤结果判断与解释：在读取和报告所测试菌株的MIC前，应检查生长对照管的细菌生长情况是否良好，同时还应检查接种物的传代培养情况以确定其是否污染，质控菌株的MIC值是否处于质控范围。以肉眼观察，药物最低浓度管无细菌生长者，即为受试菌的MIC。⑥测试结果表明，化合物1具有突出的抗菌活性，相比临床在用的治疗革兰阳性菌引起感染的抗菌药物而言具有明显的抗菌优势，MIC90为（48±4） mg·L-1，小于左氧氟沙星[左氧氟沙星>（58±5） mg·L-1]。

[参考文献]

[1] 聂凌鸿. 芦荟的开发利用[J]. 食品研究与开发，2006（2）：144.

[2] 何献君，张雪丹，吕光璞，等. 芦荟抑菌作用的研究进展[J]. 实验技术与管理，2009（6）：215.

[3] 吴小芳，万金志，钟佳胜，等. 芦荟化学成分的研究进展[J]. 热带作物学报，2015（8）：1542.

[4] Ibrahim S R M， Mohamed G A. Naturally occurring naphthalenes： chemistry， biosynthesis， structural elucidation， and biological activities [J]. Phytochem Rev， 2016， 15：279.

[5] Hu Q F， Zhou B， Gao X M， et al. Antiviral chromones from the stem of Cassia siamea [J]. J Nat Prod， 2012， 75：1909.

[责任编辑 丁广治]