合欢皮总皂苷抗肿瘤作用靶点鉴定与分子机制解析
2017-10-28钱薏韩清华刘丹屠鹏飞曾克武梁鸿
钱薏+韩清华+刘丹+屠鹏飞+曾克武+梁鸿
[摘要] 合欢皮作为常用中药,临床常用于治疗失眠、焦虑、肿瘤等。现代药理中针对合欢皮总皂苷(TSAJ)抗肿瘤活性多有报道,但由于单体成分分离困难,药理机制难以开展。该研究采用MTT法和Hoechst 33258染色法,确认了TSAJ对肝癌细胞的生长抑制作用,构建了表面修饰有TSAJ的固相亲合微球,利用该固相微球特异性地从人肝癌细胞裂解液中富集靶点蛋白,再利用高分辨质谱对富集到的靶点蛋白进行鉴定。采用MataboAnalyst 3.0处理数据,筛选并确定了Exportin-2,Beta-actin-like protein 2,Myosin-9,Protein transport protein Sec61 subunit beta,Cytochrome c oxidase copper chaperone等5个靶点蛋白。这些蛋白分别具有调控细胞凋亡及细胞生长、分化、运动等功能,提示TSAJ的抗肿瘤机制可能与诱导细胞凋亡及抑制肿瘤血管生成有关。综上所述,该研究利用TSAJ修饰的固相亲和微球,特异性富集并鉴定了TSAJ的靶点蛋白,从靶点源头上解释了TSAJ抗肿瘤作用机制,同时也为中药复杂体系的分子药理机制研究提供了一种全新的思路。
[关键词] 合欢总皂苷; 抗肿瘤; 靶点鉴定; 信号通路; 作用机制
[Abstract] Dried stem bark from Albizia julibrissin(AJ) is a common traditional Chinese herb with several therapy effects including insomnia, anxiety and anti-tumor. Recently, the anti-tumor effect and mechanism studies of AJ have drawn much attention; however, there are still some troubles in chemical composition separation, which leads to the difficulties in pharmacological research of AJ. In this study, we firstly confirmed the proliferation inhibitory effect of total saponins from AJ(TSAJ)on human hepatocarcinoma(HepG2) cells, and also tested the apoptosis induction effect of TSAJ. Then, we successfully captured the potential target proteins from HepG2 lysates by using TSAJ-modified solid beads, and identified the target proteins by LC-MS/MS. Finally, we confirmed 5 target proteins including Exportin-2, Beta-actin-like protein 2, Myosin-9, Protein transport protein Sec61 subunit beta,and Cytochrome c oxidase copper chaperone, which are responsible forcell apoptosis, proliferation, differentiation andmigration. In summary, our findings elucidate the potential anti-tumor mechanism of TSAJ from the direct target proteins, and provide a new insight for exploring the pharmacological mechanism of traditional Chinese medicine.
[Key words] total saponins from Albizia julibrissin; anti-tumor; target; pathway; mechanism
合歡皮首载于《神农本草经》,是豆科植物合欢Albizia julibrissin Durazz.的干燥树皮,具有安神解郁,活血消肿的功效[1],常用于心神不安、忧郁失眠、肺痈疮肿、跌扑伤痛等。现代药理研究表明,合欢具有镇静、抗肿瘤、抗生育,抗菌等多种作用[2-5]。合欢皮总皂苷(TSAJ)是合欢皮的主要化学成分[6],近年来对其抗肿瘤作用多有报道。本课题组前期研究发现,TSAJ体内体外抗肿瘤效果都十分显著,体内给药荷瘤小鼠抑瘤率高达30% [7]。但由于皂苷类单体成分分离困难,合欢皮皂苷的抗肿瘤机制研究却鲜有深入报道。
药物靶点的阐明是了解药物作用机制的重要前提,对从源头上揭示药物的分子机制具有重要的指导意义[8]。作者通过把中药活性成分与固相亲和微球表面进行键合,利用中药活性成分作为探针,直接从细胞中“钩钓”直接作用靶点,进而对靶点蛋白的生物学功能进行分析并解释其药理机制。在本研究中,作者构建了表面修饰TSAJ的固相微球,特异性地富集了人肝癌细胞裂解液中的靶点蛋白,然后进行高分辨质谱分析和鉴定,最终采用MataboAnalysis 3.0筛选并确定靶点蛋白。通过对靶点蛋白生物学功能解析,阐释了TSAJ的潜在分子药理机制,为诠释中药多成分、多靶点的作用机制提供了新的思路。endprint
1 材料
1.1 药物 合欢皮药材购于陕西,经北京大学药学院天然药物学系尚明英副教授鉴定为豆科植物合欢的干燥树皮。HepG2人肝癌细胞系购自于中国医学科学院细胞中心。
1.2 试剂与仪器 DMEM培养基(Macgene,中国);胎牛血清(PAN Biotech,德国);Epoxy-activated SepharoseTM 6B(GE Healthcare,美国);溴化噻唑蓝四氮唑(MTT)(Sigma,美国);Hoechst 33258染色液(碧云天生物技术有限公司,中国);Sunrise-Basic酶标仪(TECAN公司,美国);细胞培养箱(SANYO,日本);DXS-3台式显微镜(上海缔伦光学仪器,中国);CIX100显微镜(OLYMPUS,日本)。
2 方法
2.1 细胞培养 将细胞用DMEM培养基(含10%FBS和100 U·L-1青霉素,100 μg·L-1链霉素)进行传代培养,每2~3 d传代1次,保证实验用细胞在对数生长期中。
2.2 合欢皮总皂苷的制备 合欢皮(18 kg)经粉碎后,依次用8~10倍量95%乙醇(提取3次)和50%乙醇(提取8次)渗漉法提取,合并提取液并减压回收溶剂至无醇味,再加适量的去离子水混悬,然后用2~4倍量乙酸乙酯和正丁醇分别萃取4次。用大孔吸附树脂(18 L)对水相(883.5 g)进行处理,依次以水,20%,40%,60%,95%乙醇-水进行洗脱,根据TLC和HPLC结果将其分成3个组分,将皂苷类的组分3与正丁醇萃取物合并后共1.2 kg样品拌样,分2次上样于硅胶柱(100~200 目),采用二氯甲烷-甲醇-水(100∶0∶0,10∶1∶0.1,5∶1∶0.1,5∶1∶0.1,7∶3∶0.5,6∶4∶1)梯度洗脱,根据TLC检测结果合并成13个流分(1~13),其中总皂苷为组分9[9]。
2.3 MTT法检测细胞存活率 将对数生长期的细胞以5×103个/L的密度接種于96孔板中,培养12 h,将上清替换成含药培养基,培养24 h后,弃上清,加MTT(2.5 g·L-1)温箱孵育2 h,弃上清,加入DMSO复溶显色,用酶标仪在570 nm波长下检测吸光度A。
2.4 Hoechst 33258染色检测细胞凋亡 将细胞以3×104个/L接种于内置无菌玻片的24孔板中,培养12 h至细胞贴壁,将上清换成含药培养基。24 h后,弃去培养基,加入4%多聚甲醛固定30 min;将多聚甲醛吸走,加入PBS清洗,清洗3次;弃去PBS,加入Hoechst 33258染液,染色30 min;将染液吸走,加入PBS清洗,每次5 min,清洗3次。最后,在载玻片上滴加甘油,封片,用荧光显微镜(激发波长352 nm,发射波长461 nm)观察(×200)细胞核形态。
2.5 表面键合TSAJ的固相微球制备 使用环氧基琼脂糖凝胶微球,微球表面用1,4-双(2,3-环氧丙烯基-)丁基作为连接臂偶联环氧基团。使用前,先将微球溶胀并清洗,取500 μL含水微球与500 μL TSAJ溶液混合,37 ℃孵育过夜即可。制备好的固相微球放置于4 ℃避光保存。
2.6 TSAJ靶点群的富集 将表面键合了TSAJ的固相微球与HepG2人肝癌细胞裂解液混合,置于4 ℃孵育过夜,然后用含0.01%NP40的洗脱缓冲液(50 mmol·L-1Tris pH 7.5,100 mmol·L-1NaCl,5 mmol·L-1EDTA,1 mmol·L-1DTT,0.01% NP40)清洗微球6次,离心并收集固相微球。加入含6 mol·L-1尿素和10 mmol·L-1DTT的PBS溶液,65 ℃加热15 min,然后加入25 mmol·L-1碘乙酰胺继续振摇孵育30 min。加入酶解缓冲液(2 mol·L-1尿素,1 mmol·L-1CaCl2,2 mg胰酶),37 ℃孵育过夜[10]。
2.7 高分辨质谱(LC-MS/MS)技术鉴定和半定量分析 微球经蛋白酶解后获得混合肽段样品,经0.22 μm微孔滤膜过滤后利用二维液相色谱-串联质谱系统(nano-LC-MS/MS)对各肽段进行鉴定。nano-LC-MS/MS由EASY-nLC-Ⅱ液相色谱仪和LTQ-Orbitrap离子阱串联质谱(Thermo Fisher Scientific,美国)组成。吸取10 μL样品溶液加样至Captrap Peptide柱,洗脱除杂后进入RP-C18AQ毛细管液相色谱柱(100 μm×15 cm,Michrom Bioresources,美国)进行梯度分离。流动相由0.1%甲酸水溶液(A)和0.1%甲酸乙腈(B)组成,梯度洗脱条件为:0~105 min,2%~40%B;105~110 min,40%~95%B;110~120 min,95%B。洗脱流速为300 nL·min-1。采用正离子模式采集数据,电喷雾电压为1.8 kV,质谱扫描模式为全扫描,扫描范围设置为m/z 350~2 000。利用蛋白质组学分析软件平台Thermo Proteome Discoverer(1.4)所含的SEQUEST检索软件对获得的PMF或CIDMS/MS肽段数据进行检索匹配,鉴定蛋白质成分并记录响应值。
2.8 潜在靶点筛选及蛋白功能解析 所有数据采用MataboAnalyst 3.0中的Biomarker Analysis模块进行t检验(P<0.05)和倍数变化分析(Fold change≥2),筛选得到最终5个靶点蛋白。采用UniProt数据库中的UniProtKB搜索功能(http://www.uniprot.org/,Update in 2017-06-22),通过输入蛋白名称并限定物种为人,将所有检索得到的蛋白校正为其官方名称(Official Symbol),经上述数据库检索和转化操作,获取靶点蛋白功能信息。endprint
3 结果与分析
3.1 TSAJ对人肝癌细胞系HepG2的生长抑制作用 MTT法检测了TSAJ对HepG2细胞的生长抑制作用,发现TSAJ在0.78~12.5 mg·L-1对HepG2细胞的生长抑制作用具有浓度依赖性,见图1,IC50为7.93 mg·L-1。
3.2 TSAJ显著增加HepG2细胞凋亡率 为了进一步验证TSAJ通过诱导细胞凋亡发挥抗肿瘤作用,将不同浓度TSAJ给药HepG2细胞,作用24 h后,通过Hoechst 33258法染色检测细胞凋亡。结果显示,TSAJ处理细胞后,细胞核随给药浓度增大越来越小,出现染色质固缩的现象;核发出的蓝色荧光逐渐增强,出现如黄色箭头所示的核凋亡现象,见图2。统计发现,TSAJ能显著增加HepG2细胞的凋亡率。
3.3 TSAJ作用靶点群的富集与鉴定 利用环氧基琼脂糖凝胶固相微球作为载体,构建了表面修饰了TSAJ的固相亲和微球。TSAJ修饰后,固相微球颜色明显加深。同时显微镜下发现,微球形状没有发生明显改变,但微球表面质感发生变化,反光性增强,进一步确认TSAJ成功键合在了固相微球表面,见图3。
采用表面修饰了TSAJ的固相微球和HepG2人肝癌细胞裂解液进行孵育,特异性地对靶点蛋白进行富集。为了排除非特异性结合,实验分别设置结合组和TSAJ竞争组,向裂解液中加入TSAJ与表面键合TSAJ微球进行竞争,通过比较2组微球上的结合蛋白来筛选TSAJ特异性结合靶点。每组设置3个重复。
采用LC-MS/MS高分辨质谱对各组样品进行鉴定及半定量分析,并将数据用MataboAnalyst 3.0及UniProt数据库筛选靶点蛋白,得到的靶点蛋白名称及功能见表1。
3.4 TSAJ作用靶点群的功能解析 通过UniProt搜索并发现,Exportin-2和Cytochrome c oxidase copper chaperone均与细胞增殖、细胞凋亡相关,其中Exportin-2為细胞核转运通道受体蛋白,又称细胞凋亡易感蛋白[11];Cytochrome c oxidase copper chaperone为细胞色素C氧化的铜配体,参与细胞呼吸作用,与细胞生长关系密切[12]。除此之外,Beta-actin-like protein 2与Myosin-9均为细胞的骨架蛋白,可能与肿瘤细胞分化、运动、分泌等活动相关[13]。而Protein transport protein Sec61 subunit beta则是细胞内质网中蛋白质合成及分泌转运的重要蛋白。因此猜测,TSAJ发挥抗肿瘤活性的机制可能与诱导肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤细胞血管生成有关。
4 讨论
药物靶点是新药研发的源头,药物新靶点的揭示与阐明对创新药物研究具有巨大的推动作用。中药在我国有近千年的临床使用历史,疗效稳定、明确,但是中药的成分复杂,从而导致了作用靶点的多样性[14]。因此,关于中药活性成分作用靶点的研究一直是中药研究领域中极具挑战性的问题。
合欢皮作为一味常用中药,临床上常用于治疗失眠、焦虑、肿瘤等症[15]。近年来,合欢皮中主要成分TSAJ的抗肿瘤作用多有报道,然而由于皂苷类单体成分分离困难,具体抗肿瘤机制研究鲜有深入报道。本研究首先验证了TSAJ的抗肿瘤作用,然后以TSAJ为探针,富集并寻找了与其特异结合的靶点蛋白,从源头上深入阐释了TSAJ的抗肿瘤作用分子机制,解决了中药成分复杂带来的靶点多、作用机制不明的问题。
通过对筛选得到的靶点蛋白进行功能解析,发现TSAJ发挥抗肿瘤活性的机制可能与诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞运动及血管生成有关。其中Exportin-2和Cytochrome c oxidase copper chaperone均与细胞增殖和细胞凋亡相关,参与胞核胞质转运及细胞色素C氧化;此外还有细胞骨架蛋白Beta-actin-like protein 2与Myosin-9,参与肿瘤细胞分化、运动、分泌等活动。然而,TSAJ与靶点蛋白作用机制及TSAJ诱导肿瘤细胞凋亡的机制还需要进一步研究。
综上所述,本研究利用活性明确的中药提取物作为探针,通过构建了中药提取物修饰的固相微球,富集并研究中药提取物的直接作用靶点。这在中药活性研究中尚不多见,有较高的新颖性,从源头上解决了中药因多成分多靶点所导致的分子机制不明的问题,为中药活性研究提供了新的思路。
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[责任编辑 张宁宁]endprint