加味五子衍宗丸神经保护作用靶点群的鉴定与功能分析
2017-10-28曾克武万彦军廖理曦姜昆王学美刘莲英屠鹏飞
曾克武+万彦军+廖理曦+姜昆+王学美+刘莲英+屠鹏飞
[摘要] 中药复杂体系的作用靶点群鉴定是中药药理机制研究的关键。该研究构建了一种表面键合有光敏二苯甲酮基团的磁性微球,利用紫外光激发下二苯甲酮基团活化并与中药化学成分中的碳氢键发生共价键合的特性,将中药加味五子衍宗丸的化学成分组键合到磁性微球表面,并与神经细胞裂解液共孵育,进而富集加味五子衍宗丸对应的神经保護靶点群。针对靶点群进行蛋白质组学分析,共发现32个潜在结合靶点。KEGG分析发现这些靶点主要与Hippo和Cell cycle信号通路关系密切,提示加味五子衍宗丸可能参与调控神经干细胞增殖和促进神经细胞分化。该研究从靶点源头上解释了加味五子衍宗丸发挥抗痴呆和神经保护作用的潜在药理机制,进而也提供了一种用于解析中药复杂成分体系作用靶点群的研究方法,可为今后中药方剂药理机制的科学诠释提供重要的方法学借鉴与参考。
[关键词] 靶点鉴定; 加味五子衍宗丸; 神经保护; 靶点群; 作用机制
[Abstract] Targets group identification in complex Chinese medicine system is a key step for revealing the potential mechanism of Chinese medicine. The solid beads with magnetic core and benzophenone-modified surface were made in our study, and then benzophenone was activated and cross-linked with the C-H bonds of chemical compositions in Chinese medicines under UV excitation. Thus the chemical compositions of modified Wuzi Yanzong pill(MWP) were linked to the solid bead surface, and enriched the neuroprotective targets group of MWP after being co-incubated with nerve cell lysate. We performed proteomics analysis on these targets and discovereda total of 32 potential binding targets. KEGG analysis revealed that these targets were mainly associated with Hippo and Cell cycle signaling pathways, suggesting that MWP might be involved in regulating the proliferation and differentiation of neural stem cells. Our findings elucidate the potential targets and mechanism of MWP on anti-dementia and neuroprotection, and further providean approach for investigating the targets group in complex Chinese medicine system. This novel method may provide methodological references for exploring the pharmacological mechanism of Chinese medicinal formulae in the future.
[Key words] target identification; modified Wuzi Yanzong pill; neuroprotection; targets group; mechanism
靶点是药物分子发挥疾病治疗作用的关键生物学基础,因此药物靶点的阐明对于揭示药物作用机制至关重要。中药具有多成分、多靶点的作用特点,寻找合适方法探究中药复杂体系的作用靶点群,不仅有利于理解中药的独特作用机制,而且还可从中找到一些全新的作用靶点,进而为今后基于靶点的创新药物设计提供重要技术参考[1-2]。
加味五子衍宗丸是在古方五子衍宗丸的基础上加味淫羊藿而成的中药方剂,主要包含菟丝子、枸杞子、五味子、覆盆子、车前子和淫羊藿,在临床上对治疗老年痴呆以及早期轻度认知障碍有确切疗效[3-4]。但是其成分复杂、作用靶点繁多,对其发挥神经保护作用的分子机制一直未能进行深入阐明。本研究试图制备一种表面修饰有光敏二苯甲酮基团的磁性微球,通过光活化反应将加味五子衍宗丸的化学成分组键合到微球表面,进而与神经细胞裂解液混合孵育,富集相应的靶点群并进行高分辨质谱鉴定。通过对靶点群中每个靶点的生物学功能解析,阐释了加味五子衍宗丸神经保护作用的分子机制。本研究不仅为加味五子衍宗丸的抗痴呆药理机制研究提供了一种全新的研究思路,而且对今后其他同类中药或复杂方剂体系的作用机制研究也具有重要的借鉴意义。
1 材料与方法
1.1 药材 加味五子衍宗丸各单味药材:枸杞子、菟丝子、覆盆子、五味子、车前子、淫羊藿购自北京同仁堂有限责任公司。各药材按质量比8∶8∶4∶1∶2∶8混合,并用10倍量超纯水煮沸提取2次,每次提取时间为1 h。将提取液混合后低温冷冻干燥成粉末,备用。
1.2 试剂 SHSY5Y神经胶质细胞系购自中国医学科学院细胞中心,DMEM培养基购自Macgene公司,胎牛血清购自PAN Biotech公司。endprint
1.3 仪器 冷冻干燥机(FDU-1100,Eyela,日本);微量紫外分光光度计(ND-1000,NanoDrop公司,美国);Sunrise-Basic酶标仪(TECAN公司)。
1.4 细胞培养与处理 SHSY5Y神经胶质细胞系用高糖DMEM培养基(含10%胎牛血清,100 U·L-1青霉素,100 μg·L-1链霉素)进行传代培養,每2 d传代1次。收集1×107左右的细胞,加入细胞裂解液(Tris,pH 7.4,150 mmol·L-1 NaCl,1% NP-40,cocktail蛋白酶抑制剂)后,冰浴30 min,然后在4 ℃下12 000 r·min-1离心20 min,取上清液并保存。
1.5 磁性光敏微球的制备 采用共沉淀法制备Fe3O4纳米粒子:将FeSO4·7H2O(0.35 g),FeCl3·6H2O(0.32 g),HS-PEG1k-SH(0.1 g,按文献方法自制[5])及30 mL去离子水加入100 mL三口烧瓶中;搅拌、通N2,温度升至70 ℃;30 min后,迅速加入4 mL的NH3·H2O(25%),继续反应2 h;用磁铁分离所得Fe3O4纳米粒子(Fe3O4-PEG1k-SH NPs),分别用去离子水、甲醇洗涤至少3次,然后分散于少量甲醇中备用。
在100 mL三口烧瓶中加入Fe3O4-PEG1k-SH NPs(0.05 g),丙烯酰氧基二苯甲酮(ABP,0.01 g,按文献方法自制[6]),三乙胺(TEA,30 μL)和20 mL丙酮,通N2、室温、搅拌反应3 h,所得磁性粒子(Fe3O4-PEG1k-BP NPs)分别用丙酮、甲醇洗涤至少3次,然后分散于少量甲醇中备用。
1.6 磁性微球表面键合中药化学成分 在一带磨口、平面石英盖的直管光照反应瓶中,加入Fe3O4-PEG1k-BP NPs(0.01 g),加味五子衍宗丸(0.01g)及20 mL去离子水,通N2 30 min后置于UV光下(375 W汞灯,光强12.5 W·m-2,λ=254 nm)反应1 h,用磁铁分离所得磁性粒子,并用去离子水洗涤至少3次。然后采用红外光谱法比较微球在键合加味五子衍宗丸前后光谱变化,结果发现利用微球表面BP光敏基团键合加味五子衍宗丸后,3 440 cm-1处羟基吸收峰变的尖锐,说明键合加味五子衍宗丸化学组分后粒子表面羟基形成氢键缔合;此外,红外谱图中明显呈现出加味五子衍宗丸化学组分在1 620 cm-1处的特征吸收峰,也表明微球表面成功键合了中药分子。
1.7 靶点群的富集与鉴定 将表面键合加味五子衍宗丸化学成分组的磁性微球与SHSY5Y神经胶质细胞裂解液混合后,于4 ℃下孵育12 h,以充分捕获靶点蛋白。然后用洗脱液(Tris,pH 7.4,150 mmol·L-1NaCl,1% TritonX100,cocktail蛋白酶抑制剂)反复清洗微球6遍,并加入200 μL的loading buffer(2×),煮沸5 min。然后5 000 r·min-1离心2 min,取上清液并进行SDS-PAGE凝胶电泳。银染后对捕获的靶点蛋白条带进行显影,并对所有蛋白条带进行酶解和高分辨质谱鉴定,进而确定每个靶点蛋白的属性及名称。
1.8 作用靶点群的KEGG通路分析[7]利用DAVID 6.7(https://david-d.ncifcrf.gov/)在线分析工具对全部靶点蛋白进行 KEGG 路径分析,在Upload框架中粘贴所有靶点蛋白对应的基因ID。选择P<0.05表示差异具有统计学意义。
2 结果与分析
2.1 加味五子衍宗丸神经保护作用靶点群的富集与鉴定 对富集所得靶点蛋白进行凝胶电泳、银染,共发现16条主要蛋白条带。对每个蛋白条带分别酶解后,进行LC-MS-MS高分辨质谱鉴定,共计发现32个潜在结合靶点蛋白(图1)。因此推测:加味五子衍宗丸的作用靶点群可能主要包括这32个靶点。此外,选取了其中的5个关键靶点蛋白(14-3-3zeta,CDK1,Hsc70,Hsp70,Prxd1),并采用Western blot法进行了验证,结果发现这些蛋白均能够被加味五子衍宗丸微球所特异性富集。
2.2 加味五子衍宗丸作用靶点群的分类与功能解析 根据鉴定所得靶点群,按照不同蛋白功能进行分类,主要可分为如下10类功能靶点蛋白。①细胞能量代谢:主要包括ATP synthase subunit beta,pyruvate kinase;②蛋白质量控制:主要包括heat shock cognate 71 kDa protein(Hsc70),heat shock 70 kDa protein(Hsp70),ATP-dependent Clp protease,ubiquitin thioesterase,vesicle-associated membrane protein-associated protein;③细胞凋亡:主要包括Rho-related GTP-binding protein,14-3-3 protein;④离子通道:主要包括voltage-dependent anion-selective channel,chloride intracellular channel protein;⑤细胞增殖与分化:主要包括eukaryotic translation initiation factor 3,stress-70 protein,stress-induced-phosphoprotein,serine/threonine-protein kinase,cyclin-dependent kinase 1(CDK1);⑥线粒体功能调控:主要包括78 kDa glucose-regulated protein,calcium-binding mitochondrial carrier protein,hydroxyacyl-coenzyme A dehydrogenase,phosphate carrier protein;⑦抗氧化:主要包括catalase,peroxiredoxin-1(Prdx1),pyrroline-5-carboxylate reductase;⑧神经突触发育:isoform 2 of ATPase family AAA domain-containing protein,Ras-related protein Rap-1A;⑨炎症与免疫调控:elongation factor 1-alpha;⑩其他:actin,60S acidic ribosomal protein,guanine nucleotide-binding protein。endprint
2.3 加味五子衍宗丸抗痴呆和脑保护作用的机制诠释 通过生物信息学分析,作者对鉴定得到的32个靶点蛋白进行了研究。KEGG分析发现,这些靶点主要与4条信号通路相关,包括:Hippo signaling pathway,Cell cycle,Biosynthesis of antibiotics和Shigellosis(图2)。其中,加味五子衍宗丸与Hippo和Cell cycle 2条信号通路的相关性更为密切(P<0.05)。在Hippo信号通路中主要包含chloride intracellular channel 4和ras homolog family member G等靶点。在Cell cycle信号通路中主要包含hydroxyacyl-CoA dehydrogenase,catalase,pyruvate kinase和pyrroline-5-carboxylate reductase等靶点。其中,加味五子衍宗丸对Hippo通路的调控作用可能主要体现在对神经干细胞的调控方面,因为神经干细胞在中枢神经系统疾病中发挥了重要作用,因此推测加味五子衍宗丸的活性成分可能通过促进神经干细胞增殖和诱导神经细胞分化进而起到神经保护和改善神经病理损伤的作用[8]。此外,加味五子衍宗丸还可能通过作用于Cell cycle信号通路,促进神经前体细胞的周期进程,进而加快神经前体细胞的增殖以及向神经元的分化[9]。因此,Hippo和Cell cycle通路作为调控神经干细胞增殖和促进神经细胞分化的重要信号级联反应,在加味五子衍宗丸的抗痴呆和脑保护作用中发挥了重要角色。
3 讨论
如何将中药复杂体系的作用靶点群从细胞中特异性富集出来并进行鉴定是本研究的关键。在此制备了一种表面含光敏二苯甲酮基团的磁性微球,二苯甲酮基团在紫外光激发下可以活化为碳自由基,进而与中药活性分子中的碳氢键发生化学键合,鉴于中药活性分子大多具有碳氢键,因此利用该法可以实现将中药复杂体系的化学成分整体键合到磁性微球表面,进而用于后续靶点富集的操作。此外,磁性微球在磁力架上可迅速从细胞裂解液中分离,不必反复高速离心,大大简化了操作程序,更易进行靶点富集实验。
在对鉴定得到的靶点群进行生物学功能分析后发现:靶点大致可分为10类,包括细胞能量代谢、蛋白质量控制、细胞凋亡、离子通道、细胞增殖与分化、线粒体功能调控、抗氧化、神经突触发育、炎症与免疫调控以及其他功能等。细胞能量代谢、线粒体功能调控相关靶点可能主要是改善并增强神经细胞线粒体内的ATP合成,提高线粒体功能,进而为神经细胞提供更多的能量;蛋白质量控制类靶点可能主要参与了清除神经细胞内不正常蛋白(比如β淀粉样蛋白)的合成;细胞凋亡、细胞增殖与分化类靶点可能是调控神经细胞的存活与凋亡通路,进而增强神经细胞的活力;离子通道、神经突触发育类靶点可能是要参与了神经信号传导与通讯,进而增强了神经元的信息传导功能;抗氧化类靶点主要是清除神经细胞内的氧化自由基,进而使神经细胞免受氧化性损伤;炎症与免疫调控类靶点可能是通过调控炎症相关信号通路进而抑制神经炎症反应,降低神经炎性损伤。此外,通过KEGG通路富集分析发现加味五子衍宗丸可能主要是通过作用于两大类信号级联发挥抗痴呆和脑保护作用的,即Hippo和Cell cycle通路。这2个通路均涉及到神经干细胞的增殖与分化进程,因此推测加味五子衍宗丸的核心调控机制可能是靶向与神经干细胞或神经前体细胞,并通过促进神经元新生和定向分化实现抗痴呆和脑保护作用的[10-11]。综合来看,加味五子衍宗丸的活性成分可能涉及到多个方面的神经功能调节,这也正好体现了中药方剂多成分、多靶点的作用特色。
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[责任编辑 张宁宁]endprint