细菌纤维素高产菌株的筛选及鉴定

摘要：细菌纤维素具有高结晶度、生物可降解性和合成可调控性等优良特性，被公认为是一种性能较好的纤维素，广泛应用于食品、医学、造纸、声学等领域。笔者在研究中发现，实验室自制荞麦醋自然放置一段时间后，液面上长出厚厚的凝胶状膜，经成分分析，确定该膜成分为纤维素，结晶度为78%，Iα型纤维素含量为60%。取该荞麦醋的醪液，经富集、分离、初筛和复筛等，最终从108个单菌落中筛选出1株性能稳定的纤维素高产菌株J2，纤维素产量可达 8762 g/L（湿质量）。通过形态学与基于16S rRNA序列的分子生物学鉴定，确定菌株J2为汉森氏葡糖醋杆菌（Gluconacetobacter hansenii，GenBank登录号为GU213109）。

关键词：细菌纤维素；菌株；鉴定；汉森氏葡糖醋杆菌

中图分類号： S182文献标志码：

文章编号：1002-1302（2017）16-0282-04

收稿日期：2016-10-19

基金项目：陕西省科技厅自然科学基础研究计划（编号：2016JQ3036）。

作者简介：葛含静（1981—），女，陕西咸阳人，博士，讲师，主要从事粮食工程与发酵技术创新、食品化学与营养学等方面的研究。E-mail：gehanjing1981@163com。

细菌纤维素（bacterial cellulose，简称BC）是某些海洋生物（如被囊纲动物）、细菌（醋酸杆菌、假单胞杆菌、土壤杆菌、无色杆菌、八叠球菌等菌属的细菌）代谢产物，由β-1，4-D-吡喃葡萄糖聚合而成，不掺杂任何其他形式的多糖，纯度极高。与普通植物纤维相比，BC机械强度高、吸水保水率高、生物适应性良好，被认为是性能较好的纤维素，广泛应用于食品、医药、造纸、石油开采等领域。

目前，学术界对BC的合成研究主要是围绕培养基及培养条件的优化、菌株的代谢工程改造、高产菌株的自然选育及诱变选育等方面展开。陈军等利用糖厂副产物——酸化糖蜜生产BC，发现产量显著提高，且用红茶菌的复合菌种能更高效地利用碳源[3]。夏露等利用甲醇废水发酵生产BC，发现以木醋杆菌静态发酵，BC产量较低[4]。杨雪霞等研究发现，剪切力会影响纤维素产生菌的形态和生物量，不利于BC合成[5]。翁媛媛等以惰性吸附载体固态发酵生产BC，在避免剪切力的同时，增加了固液界面的表面积，BC产量为液态静置发酵产量的3倍，但后处理难度增加了很多。de Melo等对汉森氏葡糖醋杆菌（Gluconacetobacter hansenii） ATCC23769纤维素合成酶操纵子中部分基因进行克隆，采用过表达这些基因以期提高BC产量。周胜虎等从腐烂的水果中自然分离得到BC产生菌JX303335[8]。余晓斌等通过紫外诱变[9]，杜双奎等通过高静水压诱变方法[10]实现了BC高产突变株的成功选育。尽管BC生物合成的研究在各个方面都取得了长足进展，但从源头上自然筛选出性能稳定的BC高产菌株，优化其发酵条件，表征其产BC性能相关指标，仍具有重要的研究意义。本研究初步筛选出了1株BC产量高且传代稳定的菌株J2，并拟对其进行鉴定，同时，拟对菌株J2所产BC的超微结构和超分子结构也作鉴定，为后续通过诱变或基因工程方法选育优良的BC产生菌株奠定基础。

1材料与方法

11试验材料

本试验所用材料为笔者所在实验室自制荞麦醋。

12试验试剂

细菌基因组提取试剂盒、2 000 bp DNA marker、Ex Taq酶，均购自日本TaKaRa公司。DNA胶纯化及回收试剂盒，购自美国Amersham Biosciences公司。细菌16S rRNA通用扩增引物F9/R1510及测序引物F9、R1510和F520，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。其他试剂均为分析纯级或生化试剂级。

13培养基

富集培养基：20 g/L葡萄糖，5 g/L酵母膏，1 g/L K2HPO4，10 g/L MgSO4·7H2O，无水乙醇体积分数为2%，005 g/L 制霉素，pH值自然。

基础种子培养基：20 g/L葡萄糖，5 g/L酵母膏，1 g/L K2HPO4，15 g/L MgSO4·7H2O，无水乙醇体积分数为2%，pH值自然。分离培养基、斜面保藏培养基配方在基础种子培养基的基础上加17%琼脂。

基础发酵培养基：20 g/L葡萄糖，5 g/L酵母膏，1 g/L K2HPO4，10 g/L MgSO4·7H2O，无水乙醇体积分数为2%，pH值自然。

所有培养基均于121 ℃高压灭菌15 min后备用。

14方法

141菌种筛选[11]富集：自制荞麦醋于自然条件放置一段时间，液面长出厚厚的凝胶状膜。经成分分析，确定为BC。吸取10 mL该醋样，加到90 mL富集培养基中，30 ℃培养 4 d，培养基表面长出BC。

分离：吸取1 mL长膜的富集培养液，用无菌生理盐水稀释成浓度梯度为10-1、10-2、…、10-7的溶液。吸取后3个浓度梯度的稀释液各02 mL，涂布于分离培养基平板，30 ℃培养5 d，选择菌落长势良好、分布均匀且菌落数适中的1个平板，挑取所有单菌落，接种于斜面培养基，30 ℃培养18～24 h，长出丰厚菌苔后，保藏于4 ℃冰箱。

初筛：将保藏的菌种各挑取1环，分别接种于10 mL基础发酵培养基，30 ℃培养5 d，筛选产BC的菌株，挑取其菌膜，连续2次划线分离，镜检为纯培养物后，斜面保藏于4 ℃冰箱。

复筛：挑取纯化的菌株接种于基础种子培养基，连续5代传代培养，测定每代菌株产生的BC湿质量，筛选出产量最高且稳定的菌株。培养方法：挑取1环活化的斜面菌苔，接种于100 mL基础种子培养基，30 ℃、130 r/min振荡培养24 h进行活化，再接入基础发酵培养基进行发酵培养，测定BC产量。

BC产量的测定：将活化的种子液按10%接种量（体积分数）接入1 L发酵培养基，用8层灭菌纱布封口，30 ℃静置培养5 d，测定处理后的BC产量。BC处理方法：用蒸馏水过夜冲洗BC膜，然后浸泡于05 mol/L NaOH溶液中并煮至乳白色半透明状[12]。处理后的BC膜在滤纸上沥干，称质量（即BC湿质量）；将沥干的BC膜在烘箱中于105 ℃烘至恒质量，称质量（即BC干质量）。纤维素产量用单位体积培养液的纤维素质量表示。

142凝胶状膜成分分析[11]定性分析：在培养皿中放入1张新的载玻片，倒入蒸馏水，能覆盖载玻片即可。挑取培养 2 d 的凝胶状膜，自然平展于载玻片上，取出载玻片并晾干，向膜上滴665%硫酸，然后用碘液染色，在显微镜下观察显色情况。

酶解试验：取凝胶状膜，于105 ℃烘干至恒質量，准确称取0500 0 g，剪碎，加入纤维素酶溶液中，55 ℃长时间保温，若溶液变清亮且烘干后膜的质量减轻90%以上，则可确定凝胶状膜主要成分为纤维素。

143BC结构鉴定超微结构表征：用扫描电子显微镜（scanning electronic microscope，简称SEM）观察。BC干膜用双胶碳导电带安装在1截铜段上，用铂涂层设备为BC膜涂铂，室温进行扫描电镜拍照。

超分子结构表征：用固态13C-核磁共振光谱（muclear magnetic resonance，简称NMR）测定过夜水洗并烘干的纤维素的结晶度、晶体类型。测试频率7546 MHz，脉冲宽度 38 kHz，接触时间1 ms，转子转速5～6 kHz，转角547°，循环时间3 s，每个光谱2 400次扫描。

144菌种鉴定形态学鉴定：取对数期菌体，结晶紫染色后用光学显微镜观察菌体形态；同时，取对数期菌体划线接种于种子培养基平板，30 ℃培养3～5 d，观察菌落形态。

分子生物学鉴定：用细菌基因组提取试剂盒提取BC产生菌株基因组DNA。以基因组为模板、F9/R1510为引物扩增16S rRNA序列。产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，由生工生物工程（上海）股份有限公司测序。序列在美国国立生物技术信息中心（NCBI）的核酸数据库中进行BLAST同源性比对，用MEGA4绘制系统发育树，结合表型特征确定其生物学地位。

2结果与分析

21BC产生菌株筛选

涂布分离得到108个单菌落（依次编号为J1，J2，…，J108）。初筛发现，有9株菌能产凝胶状膜，3株所产凝胶状膜松软、有空洞。对能产膜的9株菌连续5代传代培养，发现编号J2的菌株的每一代培养物性状稳定、凝胶状膜产量最高（平均为8762 g/L），且膜外观结实、平滑、有弹性。

22凝胶状膜成分分析

被染色为深蓝色的物质在显微镜下呈无规则层状分布，包裹着未染色的杆状菌体细胞。初步判断，凝胶状膜主要成分为纤维素。酶解50 h后溶液变清亮，酶解前膜质量 0500 2 g，酶解后质量0023 6 g，因此可以算出，纤维素含量为（0500 2～0023 6）/0500 2×100%=9528%。可以判断，凝胶状膜的主要成分为纤维素。

23BC结构鉴定

超微结构：如图1所示，碱煮处理的BC中菌体残留更少；水洗与碱煮后BC超微结构没有变化，说明纯化方法对纤维素的微观结构没有影响，这与McKenna等的研究结果一致。此外，BC的微纤维直径不足01 μm，呈密集网状，很多根微纤维组成纤维丝带，进而形成不计其数的不规则、相互叠加的孔穴，即三维网状结构。这种结构持水保水性能良好，也有利于吸附有机试剂，因而BC可用作吸水材料和吸附材料，用于食品加工及药物缓释体系中[14]。

超分子结构：对比天然纤维素的NMR图谱（图2），图3中信号均为纤维素信号，说明菌株J2所产BC纯度高，进一步测定发现，该纤维素结晶度达78%，Iα型纤维含量达60%。生物材料的结晶度与其拉伸性能、尺寸稳定性及密度呈正相关[15]，因此可知，菌株J2所产BC拉伸性能及尺寸稳定性良好、密度高。Iα型是纤维素的亚稳态结构，在一定条件下可转化为稳定的Iβ晶型，BC具有很强的生物适应性且在环境中易于分解，很可能是由于其中Iα型纤维含量高[16]。因此，与高等植物相比（后者Iα型纤维含量为30%[17]），菌株J2所产BC生物适应性良好。

24菌种鉴定

241形态学鉴定J2菌体细胞呈杆状，单个或成对，大小为（212～418）μm×（081～092）μm；菌落呈圆形，表面光滑，凸起，不透明，乳白色，大小为09～14 mm，详见图4，可初步判断菌株J2为醋酸杆菌属。

242分子生物学鉴定对菌株J2进行16S rRNA序列扩增及系统发育分析，如图5、图6所示，菌株J2与菌株Ga hansenii NBRC14817、Ga hansenii NBRC14816和Ga hanseniiNBRC14820同支，相似度达100%。

微生物的分类鉴定从来没有一个黄金指标。表型特征虽然可进行表型分群，但分类学结果不够精准，因而只能用于描述微生物的表型性状特征。遗传学分类法，即根据核酸分析得到的遗传相关性所作的分类，以决定生物表型特征的遗传特征DNA和RNA作为比较的准绳，是一种更客观和高度可信的分类方法。因此，表型鉴定与遗传学分类法结合，可以更为准确地对未知微生物进行分类鉴定。结合形态学鉴定与基于16S rRNA序列扩增的分子生物学鉴定，即可确定菌株J2是汉森氏葡糖醋杆菌（Ga hansenii）。

3结论

本研究以笔者所在实验室自制荞麦醋为材料，将该荞麦醋放置一段时间后，从其表面凝胶状膜中自然分离出1株性能良好的BC高产菌株J2，其BC结晶度为78%，Iα型纤维含量为60%，表明BC密度高，拉伸性、尺寸稳定性和生物适应性均良好。通过形态学鉴定与基于16S rRNA序列的分子生物学鉴定，确定菌株J2为汉森氏葡糖醋杆菌（Ga hansenii）。

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