亚麻愈伤组织诱导和遗传转化体系建立

李雪　安胜军　邵铁梅

摘要：为了建立高效亚麻愈伤组织诱导体系，对亚麻的无菌苗培养、外植体愈伤组织诱导、愈伤组织继代扩增3个方面进行了研究。同时对农杆菌介导亚麻愈伤组织遗传转化条件进行了初步探索。结果表明，亚麻无菌苗接种培养基为MSB+1 mg/L 6-BA时有利于亚麻愈伤组织出愈，适合亚麻愈伤组织诱导的培养基为MSB+01 mg/L NAA+2 mg/L 6-BA，或在此基础上添加10 mg/L 2，4-D，2种培养基在愈伤组织诱导阶段差别不大。愈伤组织继代扩增培养基为MSB+01 mg/L NAA+2 mg/L 6-BA，在此培养基上，愈伤组织量在25 d时达到顶峰。由抗生素抗性试验得出亚麻愈伤组织卡那霉素抗性临界值为100 mg/L。亚麻愈伤组织转化的方式为浸泡材料15 min后抽真空5 min较好，遗传转化率为31%。经PCR分析验证，证明阿朴脂蛋白米兰突变体外源基因已经整合至亚麻抗性愈伤组织基因组中。

关键词：亚麻；愈伤组织；遗传转化

中图分类号： S5632043文献标志码：

文章编号：1002-1302（2017）16-0046-04

收稿日期：2017-01-20

基金项目：河北省教育厅高等学校科学技术研究项目（编号：ZD2014087）；河北省教育厅项目（编号：Z2015214）。

作者简介：李雪（1979—），女，河北赵县人，硕士，讲师，从事植物生物反应器的研究。E-mail：lixue712@126com。

通信作者：安胜军，博士，教授，从事动物细胞方面及蛋白类药物的研究与开发。E-mail：sjsjan@126com。

亚麻是一种古老的栽培植物，包含13个属300个种，主要于纤维用、油用、药用等方面。亚麻是高度自花授粉作物，常规育种方法耗时且受到遗传资源有限和近亲杂交的障碍[3]，因此基因工程新技术应用于亚麻植物上势在必行，而基因工程新技术的发展离不开植物愈伤组织快速诱导体系的建立。

自1975年至今，愈伤组织诱导在很多植物上均有研究，最早的有水稻[4]、杨树[5]、甘蔗、大蒜、小麦[8]、红豆杉[9]、大麦[10]、火龙果[11]、桑树[12]等，且取得了成功。有关亚麻的愈伤组织诱导报道较少，国外亚麻组织培养方面的研究多集中在亚麻花药愈伤培养上[13-16]，操作难度大，影响因素多，且重复性差。赵玮等发表的有关亚麻下胚轴愈伤的研究[17]，在本实验室未能很好的重复再现。同一基因型不同操作手法结果的差异，限制了亚麻愈伤组织诱导及基因转化的发展。研究亚麻愈伤组织诱导及转化，目的是以愈伤组织作为植物生物反应器原材料，转入分泌型的外源基因，提取抗性愈傷组织的蛋白，用于后续的基因工程研究。

本研究对亚麻品种陇亚10号下胚轴进行愈伤组织的诱导，探索愈伤组织诱导、扩繁增殖的条件，并建立了亚麻愈伤组织的生长曲线，初步确定了基因转化的条件，以期建立快速生长且可重复的亚麻转基因愈伤组织诱导转化体系，从而为亚麻基因转化工程发展提供参考。

1材料与方法

亚麻种子陇亚10号由新疆农业科学院提供。

11种子消毒方法

挑选无破损的亚麻种子，75%乙醇消毒1 min，5%次氯酸钠溶液消毒5 min，无菌水洗涤4次，冲洗干净后浸泡无菌水中，置摇床上过夜萌发备用。培养基：所有的培养基均以MS[18]为基本培养基。

12无菌苗种植方法

将萌发好的种子接种于无菌苗生长培养基上，无菌苗生长培养基分别为MSB、MSB+1 mg/L 6-BA。

13下胚轴诱导愈伤方法

待无菌苗长至5～7 cm时，切其下胚轴，切为05～10 cm 的小段，分别放置下胚轴诱导愈伤的培养基上。每次接种50小段，水平试验重复4次，使总接种量达到200小段左右。通过查阅资料，设置下胚轴诱导愈伤培养基：基本培养基附加不同浓度、种类植物生长调节剂（表1）。在（25±1）℃下暗培养7～14 d观察外植体的形态变化，25 d后统计外植体出愈率。

14愈伤组织生长曲线的制定方法

愈伤从诱导开始，中间继代2次后得到生长旺盛的愈伤组织。以此为基础，相同鲜质量09 g的愈伤组织接种于固体培养基，共接种12瓶。暗培养，每隔2 d取1瓶，测定愈伤组织鲜质量，直至24 d。水平试验重复1次，用2次鲜质量平均增长值制定亚麻愈伤组织生长曲线。

15继代扩增愈伤组织最适培养基的选定方法

筛选愈伤生长外观及形态均相似的2种培养基，采用上述方法制作愈伤组织生长曲线，最终确定继代扩增愈伤组织的最佳培养基。

16亚麻愈伤组织对抗生素的敏感性试验

含卡那霉素的培养基制备，分别为卡那霉素10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 mg/L处理各3瓶，共30瓶，则为3个重复试验。每瓶均接种鲜质量1 g生长旺盛的愈伤组织，25 d后测量每瓶的鲜质量增长量，选取鲜质量未增长且减少的同一组处理，为愈伤组织的卡那霉素抗性临界值。

17外源基因基于愈伤组织的农杆菌转化方法

阿朴脂蛋白米兰突变体基因命名为TA，含NPTII报告基因的质粒双元表达载体由本实验中心构建提供。侵染方法、时间等见表2。

注：农杆菌D值均为04～06。[HT][FK）]

侵染后，共培养3 d、抑菌培养7 d，抑菌用头孢噻肟钠工作浓度为300 mg/L。然后进入培养基抗性筛选阶段。

18抗性愈伤组织的继代培养及PCR鉴定

选取抗性愈伤继代3次，确定无农杆菌污染后，进行外源基因PCR分析。提取抗性愈伤的基因组DNA，以未转化的普通愈伤组织基因组DNA为阴性对照，阿朴脂蛋白米兰突变体基因的质粒为阳性对照。设计阿朴脂蛋白米兰突变体基因的扩增引物，引物命名为：endprint

其中1、2扩增阿朴脂蛋白的目的片段长度为750 bp，2、3扩增阿朴脂蛋白目的片段连接信号肽的长度为840 bp，4、5扩增阿朴脂蛋白目的片段连接信号肽、启动子后的总长为 2 070 bp。

扩增程序为：95 ℃ 10 min、95 ℃ 1 min、60 ℃ 1 min、72 ℃ 50 s、72 ℃ 10 min，30个循环。反应完成后，采用 14%～16%的琼脂糖凝胶进行电泳检测。

2结果与分析

21亚麻外植体培养

无菌苗生长的2种培养基，添加6-BA的培养基上无菌苗下胚轴不仅外观形态较未添加的粗短，而且下胚轴诱导出愈时间较未添加的早，因此在诱导愈伤组织的外植体培养上，应选择添加6-BA细胞分裂素的培养基。

22诱导愈伤

接种在不同培养基上的外植体出愈率、出根率、愈伤表披白霜率等见表3，采用DPS数据分析。结果表明，出愈率方面，培养基A5、A10与其他13种培养基有显著差异，而这13种培养基间没有明显差异，出愈率均较高。在出芽率方面，几种培养基间差异较大，其中A8、A9、A10培养基没有芽发生，A2、A7、A14培养基芽发生率较低，芽发生率最高的为A4培养基。出根率，几种培养基间也有显著差异。A7、A8、A9、A10培养基没有根发生，A2、A5、A14培养基根发生率较低，生根率最高的为A1培养基。愈伤表披白霜率方面，A0、A1、A2、A3、A4、A5、A6、A11、A12、A13、A14培养基上的愈伤组织没有出现白霜，A7培养基上的愈伤组织白霜率最高。15种培养基上的愈伤组织颜色呈现2种，分别为黄色、黄白色，愈伤组织颜色好的培养基为A0、A1、A2、A3、A4、A5、A6、A11、A12、A13、A14，不好的培養基为A7、A8、A9、A10。不同培养基培养的愈伤组织状态，是衡量培养基合适与否的一个重要指标，从表3可以看出，A2、A14培养基培养的愈伤组织状态最好，A7、A8、A9、A10培养基培养愈伤组织的状态最差。综合考虑各方面因素，亚麻诱导愈伤组织适合的培养基为A2、A14。

23愈伤组织生长曲线的制定

由不同培养天数亚麻愈伤组织的鲜质量增殖量，建立了亚麻愈伤组织的生长曲线（图1），2种培养基愈伤组织的生长曲线均呈S形。从亚麻的愈伤组织生长曲线可以看出，2种培养基上的愈伤组织在0～7 d时呈现缓慢生长。从7 d开始，A2培养基上的愈伤进入快速增长期，至25 d达到顶峰，25 d后愈伤组织生长量开始下降。A14培养基上的愈伤组织，从7 d开始也进入快速增长期，至28 d时达到顶峰，但 17～28 d期间，愈伤组织呈现平稳缓慢增长，28 d后愈伤组织生长量开始下降。从图1可以看出，A2、A14 2种培养基上的愈伤组织生长达到顶峰时的愈伤组织增长量和时间有明显的差异，A2培养基明显优于A14培养基，因此选定A2培养基为亚麻愈伤组织继代扩增的最适培养基。

24卡那霉素临界浓度值确定

从图2可以看出，卡那霉素的浓度变化对亚麻愈伤组织的增殖量有明显的抑制作用。随着卡那霉素的浓度增加，亚麻愈伤组织生长的增殖量会相应减少。当卡那霉素浓度达到

100 mg/L 时，亚麻愈伤组织出现了负增长的现象，即25 d后亚麻愈伤组织鲜质量比初接种时鲜质量减少了021 g，因此，当侵染亚麻愈伤组织时，卡那霉素100 mg/L为抗性筛选浓度。

[FK（W11][TPLX2tif][FK）]

25愈伤组织的转化分析

从表4可以看出，7种侵染方式中，只有A、B、D 3种方式能够得到抗性愈伤，且侵染后愈伤组织的颜色会有差别。农杆菌与愈伤组织浸泡过夜后得到的愈伤均为灰白色，其他2种方式得到的愈伤组织为黄褐色和红褐色。其中，抗性愈伤能够在褐色愈伤组织上生长出白色愈伤组织（图3）。A、B、D 3种方式的转化率各不相同，以B方式最高，为31%。而A、D 2种方式的转化率分别为267%、164%。因此，在用农杆菌转化亚麻愈伤组织时，适宜采用B方式转化，即对受体材料采取农杆菌菌液浸泡15 min，然后5 min抽真空处理转化方式较好。

26PCR分析

PCR扩增结果（图4）表明，随机选取的抗性愈伤组织均扩增到和阳性对照质粒同样大小的片段。阿朴脂蛋白的目的片段长度为750 bp，阿朴脂蛋白目的片段连接信号肽的长度为 840 bp，阿朴脂蛋白目的片段连接信号肽、启动子后的总长为2 070 bp，样品和质粒阳性对照片段大小均一致，且由于提取基因组DNA的样品为经过3次继代后的抗性愈伤组织材料，表明外源基因已经随机整合到亚麻愈伤组织基因组DNA中，且稳定遗传。

3讨论与结论

本研究在无菌苗培养阶段，加入了植物生长调节剂，结果缩短了亚麻下胚轴的出愈时间，为获得基因转化的原材料节约了时间，以便能快速得到转基因抗性材料，目前，还未见亚麻组培愈伤组织诱导在无菌苗培养阶段进行处理的报道。

Horsch等在植物转化上采用了叶片浸泡法[18]，本研究选择的是愈伤组织浸泡、超声或抽真空处理的转化方法，这在愈伤组织转化上属于新创。本研究发现抽真空处理提高了愈伤组织的转化率，但总体来说愈伤组织转化率偏低，因此，提高愈伤组织转化率方法还有待继续研究。

选择标记基因最早于1989年，McHughen将选择标记基因应用在亚麻植物细胞的基因转化中，并且获得了成功[19]。本研究起初设计了潮霉素抗性基因，鉴于植物愈伤组织量大且使用抗生素造价问题，所以再次设计了卡那霉素抗性基因。同时，选择标记基因的临界浓度值对于转基因产物的筛选至关重要，植物愈伤组织抗生素抗性临界浓度值的确定不直观，为了得到准确的愈伤组织抗生素抗性临界浓度值，本研究采取了定期称量愈伤组织增殖量的方法，多次重复以得到精准的卡那霉素抗性临界浓度值，期望在以后研究出简单实用适合植物愈伤组织筛选的抗生素浓度确定方法。endprint

在进行PCR分析时，一般仅需扩增转入外源基因的目的片段即可，但在本试验设计时，为了减少扩增结果假阳性的概率，同时进行了阿朴脂蛋白目的片段、阿朴脂蛋白目的片段和连接的信号肽、阿朴脂蛋白目的片段连接信号肽和启动子，层层递进式扩增，最终证明整个表达盒已经整合进抗性愈伤组织的基因组DNA中，保证了本试验的严谨性。

本研究以陇亚10号下胚轴为外植体，摸索到适合陇亚10号愈伤诱导和继代扩增的最佳培养基，建立了陇亚10号高效愈伤组织诱导体系。以愈伤组织为受体材料，研究了农杆菌介导愈伤组织的遗传转化条件，确定了转化愈伤组织最佳的农杆菌侵染时间和方式，而且筛选到合适的抗生素临界浓度。同时采用抗生素筛选和PCR电泳检测双重验证了外源基因于愈伤组织基因组DNA中的整合。

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