凤尾草中黄酮提取物对小鼠光老化损伤皮肤的修复作用

陈家明+张美琴+陈宁

[摘要] 目的 探讨凤尾草中黄酮提取物对因紫外线照射所致小鼠皮肤光老化的具体修复作用，为该植物的药用提供理论基础。 方法 选取经过紫外线照射所致光老化的40只损伤模型小鼠，按照性别匹配分为A组（不做处理）、B组（生理盐水涂抹）、C组（生理盐水+维生素C）、D组（生理盐水+黄酮芦丁提取物），每组10只。随访观察10 d，比较四组小鼠皮肤粗糙度（SER）、表面鳞屑（SESC）、皱纹评估（SEW）、愈合面积百分比、微血管密度（MVD）、皮肤愈合时间、结痂时间、绒毛生成时间的差异。 结果 第7天和第10天，A、B、C组SER、SESC、SEW均显著高于D组（均P < 0.05），愈合面积百分比、组织MVD均显著低于D组（均P < 0.05）。A、B、C组小鼠皮肤愈合时间、皮肤结痂时间、绒毛生成时间均显著短于D组（均P < 0.05），且A组小鼠的各项指标测定结果最大，而D组小鼠的各项指标测定结果最小；皮肤组织病理学检查结果显示，A组小鼠皮肤胶原纤维呈现出无规则断裂状，B组小鼠皮肤真皮层的空洞进行性扩大，C组小鼠皮肤的表皮相对完整，D组小鼠皮肤的表皮恢复情况较好，胶原纤维量也高于其他组别。 结论 生物类黄酮芦丁物质有助于皮肤光老化损伤的修复，表现在皮肤外观性状和内部组织结构上，其疗效优于维生素C，能显著提升皮肤愈合时间。

[关键词] 凤尾草；生物类黄酮；光老化；皮肤损伤；修复

[中圖分类号] R758.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）09（a）-0013-04

[Abstract] Objective To investigate the specific repairing effects of flavonoids extract from Pteris multifida Poir on photoaged skin of mice caused by ultraviolet irradiation， and to provide a theoretical basis for the medicinal use of this plant. Methods Forty damaged model mice with photoaging caused by ultraviolet irradiation were selected， according to the gender， they were divided into group A （no treatment）， group B （smeared normal saline）， group C （smeared normal saline + vitamin C）， group D （smeared normal saline + flavonoids rutin extract）， with 10 mice in each group. Follow-up observation of 10 days， the differences of surface evaluation of roughness （SER）， surface evaluation of scales （SESC）， surface evaluation of wrinkles （SEW）， percentage of healed area， microvessel density （MVD）， skin healing time， scab time and fluff generated time among the four groups were compared. Results In the 7th and 10th days， the SER， SESC， and SEW in group A， B， and C were all significantly higher than those of group D （all P < 0.05）， the percentage of healed area and MVD were significantly lower than those of group D （all P < 0.05）. The skin healing time， scab time and fluff generated time in group A， B， C were significantly shorter than those of group D （all P < 0.05）， and the results of each index in group A were maximum， and the results of each index in group D were minimum. Skin histopathologic examination showed that， the skin collagen fibre in group A showed no regular fracture， the emptiness of the dermis in group B was enlarged gradually， the epidermis of group C was relatively intact， the epidermis of group D had better recovery conditions and collagen fibers were also more than other groups. Conclusion Biological flavonoids rutin substances contribute to the repair of photoaged skin， reflected in the skin appearance and internal organizational structure， the efficacy is better than vitamin C， which can greatly enhance the skin healing time.endprint

[Key words] Pteris multifida Poir； Bioflavonoids； Photoaging； Skin damage； Repair

随着居民生活、物质水平的提高，人们对皮肤的护理有了更高的追求，但是环境的污染和人们的一些不良癖好并没有得到很有效的控制，人们皮肤损伤的问题逐渐加重[1]。随着对皮肤损伤研究的深入，人们发现广泛存在于植物界中的黄酮类化合物，具有清除皮肤中自由基、促进皮肤新陈代谢、减少色素沉着、润泽肌肤等作用[2]。凤尾草性寒、微苦，归大肠、胃经，是一种民间广泛使用、历史悠久的中草药。研究表明，该类植物中富含生物类黄酮，而黄酮可以经局部透皮吸收的方式作用于皮肤，对光损伤导致的皮肤损害有较好的效果[3]。本研究通过黄酮涂抹紫外线照射所致损伤的皮肤，分析皮肤愈合情况，以验证该物质的临床实用效果，现将结果汇报如下：

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取健康、洁净的SPF级昆明种小鼠40只，2月龄。雌雄各半，体重20～25 g，平均（22.15±2.08）g，去毛成裸鼠（由长沙医学院动物实验中心提供，编号为43006700009824），按照性别匹配将小鼠分为四组，每组10只。

1.2 方法

1.2.1 光老化所致皮肤损伤小鼠的造模 所有小鼠在波长为280～320 nm的UVB灯管下模拟紫外线长期照射，照射期间照常喂食，直至可以明显观察到裸鼠皮肤出现皱纹[4]。

1.2.2 仪器与试剂 均由长沙医学院机能实验室提供。仪器：精密分析天平（Sartorius公司，德国）；TGF-16G型离心机（上海安亭科学仪器厂）；FSH-Ⅱ型高速电动匀浆器（江苏金坛城国胜实验仪器厂）；DHG-907A型电热恒温鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）等。试剂：凤尾草（安徽亳州沪谯饮片厂，批号20150628）；芦丁标准品（上海嘉伟化学试剂有限公司，批号130198）等，所有试剂均为分析纯级别。

1.2.3 凤尾草中总黄酮的提取和纯化 称取凤尾草样品10 g，打碎机制成粉末，放置于10个100 mL锥形瓶中，使用60%浓度的甲醇按10 mL/g的比例混匀，然后置于超声波辅助下进行提取3次，每次10 min，提取液以3500 r/min的速度离心10 min，然后进行抽滤、除渣、纯化后得到生物类黄酮提取物[5]，最后提取得来的总黄酮含量。

1.2.4 黄酮含量的测定 参照周国梁等[6]《凤尾草总黄酮超声波提取工艺研究》的方法，取芦丁标准品溶液，以质量浓度（C）为横坐标、吸光度（A）为纵坐标制备标准曲线，然后将所制取的凤尾草总黄酮样品按相同步骤配置溶液，在一样的实验操作条件下测量提取液A值，再按计算提取率（%）=样品溶液中的总黄酮量/样品重×100%的公式确定含量。

1.2.5 药物剂量的配置 本研究提取的凤尾草含量为1.7255 mg/g，而Vit C则使用禾博士牌维生素C咀嚼片，每片1 g含有100 mg Vit C。按照凤尾草提取物5 mg/mL配置溶液，而Vit C则按照50 mg/mL配置，配置中均使用双蒸水进行调配，和生理盐水的体积配比则为1∶1。

1.2.6 分组及处理 A组：完全空白对照，小鼠皮肤不做任何处理。B组：用生理盐水均匀涂抹皮肤，每2小时1次。C组：用生理盐水和维生素C配置的溶液进行涂抹治疗，每2小时1次。D组：用生理盐水和黄酮芦丁提取物配置的溶液进行涂抹治疗，每2小时1次。

1.3 观察指标

于治疗第0、3、7天和10天，分别对小鼠如下指标数据进行采集，常规指标：皮肤粗糙度（SER，使用活性皮肤表面分析系统计算得出）；表面鳞屑（SESC，计算亮象素的比例得出）；皱纹评估（SEW，皱纹深度的比例）；愈合面积百分比（采用Adobe Image Ready 7.0测得，使用愈合面积/初始创面面积公式计算）；微血管密度（MVD，采用Pareek方法测得）[7]。观察皮肤愈合时间、结痂时间、绒毛生成时间。

1.4 统计学方法

采用SPSS 18.0统计软件对数据进行统计分析。计量资料用均数±标准差（x±s）进行描述，多组计量资料比较使用F检验，两组计量资料比较使用t检验。重复测量计量资料采用重复测量方差分析，若差异有统计学意义，则使用SNK-q检验对多个样本均数进行全面的两两比较。计数资料使用构成比进行描述，采用χ2检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 四组小鼠皮肤恢复情况常规指标的比较

四组小鼠皮肤恢复情况进行重复测量方差分析发现，各指标的差异均由组间处理因素和时间因素构成，而组间和时间不存在交互作用。经方差分析，第3天，四组小鼠SER、SESC、SEW比较差异均无统计学意义（均P > 0.05），愈合面积百分比、组织MVD比较差异均有统计学意义（均P < 0.05），且A、B、C组均显著低于D组（均P < 0.05）。第7天和第10天，四组SER、SESC、SEW、愈合面积百分比、组织MVD比较差异均有统计学意义（均P < 0.05），且A、B、C组SER、SESC、SEW均显著高于D组（均P < 0.05），愈合面積百分比、组织MVD均显著低于D组（均P < 0.05）。见表1。

2.2 四组小鼠恢复情况具体愈合时间的比较

四组小鼠皮肤愈合时间、皮肤结痂时间、绒毛生成时间比较差异均有统计学意义（均P < 0.05），且A、B、C组均显著低于D组（均P < 0.05），A组小鼠的各项指标测定结果最大，而D组小鼠的各项指标测定结果最小。两两比较分析其差异的具体来源，皮肤愈合指标上，A组和C组、A组和D组、B组和C组、B组和D组、C组和D组比较，差异均有统计学意义（均P < 0.05）；皮肤结痂和绒毛生成指标上，A组和B组、A组和C组、A组和D组、B组和C组、B组和D组、C组和D组比较，差异均有统计学意义（均P < 0.05）。见表2。endprint

2.3 组织病理学研究

A组能够清晰看出小鼠皮肤表皮细胞大多脱落，细胞发生变性坏死，在结构中能明显看出纵向裂痕，真皮层看到许多空洞状，胶原纤维呈现出无规则断裂状。B组小鼠皮肤表皮呈现较多坏死區域，真皮层的空洞进行性扩大，裂缝清晰明显，胶原蛋白无规则排序。C组小鼠表皮相对来说较为完整，皮肤结构清晰，但是真皮中的胶原纤维蛋白仍有一定断裂，可见少量空洞。D组小鼠表皮恢复情况较好，结构清晰，细胞形态完整，胶原细胞少见空洞、排列紧密，胶原纤维量也高于其他组别。见图1。

3 讨论

人体皮肤衰老过程中除自然老化因素外，外源性刺激物的影响也至关重要，而外源性老化的主要原因有紫外线辐射、吸烟等[8]，其共同机制为影响机体的抗氧化功能，以及氧自由基的异常增多从而加速皮肤的老化[9]。随着人类生存自然环境的恶化，因紫外线过度辐射导致皮肤光老化的现象日益突出。光老化的皮肤伤口在愈合过程中需要经过炎症、增殖和重塑共3个阶段，合理临床用药以有效调控皮肤炎症和抗氧化过程，是促进皮肤快速、完整愈合的重要渠道[10]。

紫外线（UV）照射皮肤后，尽管大部分会被表皮吸收，影响角质形成细胞，但仍有一部分会深入真皮上部，慢性的UVB辐射会随着时间长期的变化而在体内造成累积的伤害，通过产生氧自由基进而引发一系列氧化性损伤，导致皮肤色素改变，DNA氧化破坏，使皮肤发生免疫抑制反应[11-13]。而大量研究也证明，UVB辐射导致皮肤出现衰老的最关键的外界因素之一，除此之外，配体蛋白p66Shc在机体的线粒体功能、氧化应激机制中都扮演着较为重要的角色，能够促进线粒体内ROS的大量产生[14-15]。众所周知，人体内自由基数量的增多会破坏细胞正常结构，引起脂质过氧化，干扰人体皮肤的正常代谢活动，加速人体皮肤的老化。有文献表明，p66Shc蛋白分子可以抑制细胞内线粒体的氧化应激反应来实现其抗光损伤的功能[16-18]。本研究结果显示，使用凤尾草中黄酮提取物治疗，小鼠光老化皮肤的SER、SESC、SEW情况均显著好于其他组别小鼠。原因在于生物类黄酮能快速催化和消除超氧阴离子，有效抑制自由基对脂质和蛋白质的破坏，从而加快皮肤深层次组织和表观症状的恢复[12-13]。

凤尾草总黄酮能够通过提高皮肤组织SOD的酶活性有效地减少由紫外照射诱导的ROS的产生，还可以减少机体中遭受其损害的脂质过氧化物发生过氧化反应所产生的MDA，这些自由基含量的下降能够稳定羟基化酶的活性[14，17]。也有研究表明，总黄酮可以清除ROS保护细胞，提升皮肤清除过氧化物的能力，也可以有效维持机体自由基产生与清除的平衡，并增加皮肤中Ⅰ型胶原蛋白含量，阻碍皮肤组织纤维化的过程[15，18]，而且生物类黄酮会利用它本身的强氧化性阻止氧自由基的引发和氧化反应的进行，通过加快被损伤皮肤组织的重建，加速皮肤结痂、绒毛生成等愈合过程，消除炎症、分解毒物。生物类黄酮与维生素C配合使用被验证该治疗方式的安全性和稳定性是非常可靠的。

综上所述，生物类黄酮不仅可以有效地修复受损的皮肤，还能抗氧化，对修复皮肤纹理、减少皮肤皱纹以及色素都有较好的功效[19]。尽管有着各种各样的不利因素影响着人们的皮肤，但是随着人们对生物类黄酮研究的逐渐深入，相信皮肤损伤的问题会逐渐得到改善。

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（收稿日期：2017-05-02 本文编辑：张瑜杰）endprint