星点设计—效应面法优化肝素钠肌醇烟酸酯乳膏处方配比

马宏达+崔亚玲+吴琼

[摘要] 目的 通过星点设计-效面优化法，考察肝素钠肌醇烟酸酯乳膏中主药最佳配比。方法 选用预防冻伤小鼠足肿胀实验和预防冻伤大鼠局部激光多普勒血流灌注量实验作为药效筛选模型，以肝素钠、肌醇烟酸酯和促透剂氮酮为考察因素，以足肿胀抑制率和血流灌注量为药效评价指标，采用星点设计（Design-Expert 7.0软件）对肝素钠、肌醇烟酸酯和促透剂氮酮进行多因素多水平配伍实验设计，对实验结果进行数学模型预测，根据二项式拟合方程绘制出的因素对指标影响趋势的二维等高线和三维效应面图，选择最佳配伍比例组合。 结果 星点设计-效应面法结果表明，肝素钠、肌醇烟酸酯和氮酮均有一定的协同作用，试验优选处方药物的配比为：肝素钠8000 U、肌醇烟酸酯200 mg和氮酮600 mg。 结论 此方法简便易行，预测性良好，提高了试验精度，为提高组合药物的临床有效性提供科学方法和实验依据。

[关键词] 肝素钠肌醇烟酸酯乳膏；最优配比；星点设计-效应面法

[中图分类号] R943 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）09（a）-0008-05

[Abstract] Objective To optimize formulation of Heparin and Inositol Nicotinate Cream by central composite design-response surface method. Methods The model of paw edema of mice and the blood flow of rats measured by laser Doppler flowmetry （LDF） were chosen as the pharmacodynamic screening index. With the amount of Heparin， Inositol Nicotinate and penetration enhancers azone were as independent variables， the swelling inhibition rate and the blood perfusion were as the comprehensive pharmacodynamic index. Design-Expert 7.0 software was used for the experimental value， and response surface methodology was used to optimize the Heparin， Inositol Nicotinate and azone using central composite design-response surface method. The prediction was carried out through comparing the observed and predicted with the two-dimension overlaying contour and the three-dimension response surfaces. Results Heparin， Inositol Nicotinate and Azone were proved to have synergistic effectsby central composite design-response surface method. Optimal formulaiton was as following： Heparin 8000 U， Inositol Nicotinate 200 mg and Azone 600 mg. Conclusion Central composite design-response surface methodology is convenient and highly predictive in optimizing formulation of Heparin and Inositol Nicotinate Cream， which can be offered in the scientific methods and experimentation.

[Key words] Heparin and Inositol Nicotinate Cream； Optimization； Central composite design-response surface method

近年来，大量研究表明肝素钠和肌醇烟酸酯能通过不同机制缓解血管痉挛，改善末端血管微循环，具有提高机体对冷刺激耐受的新活性[1-5]。目前，肝素钠和肌醇烟酸酯已有市售软膏，用于防治冻伤，但两者长期过量单独使用，均有潜在的副作用。通过前期工作发现两者联合用药提高机体冷刺激耐受力具有协同作用，能有效降低毒副作用，提高药效，且使用方法简便，易于全军配发。故本研究从部队实际需求出发，通过星點设计-效应面法优化处方配比，拟开发一种高效、低毒、便于部队配发的复方抗寒乳膏，针对高寒地区卫生勤务需求，具有很强的适用性，在一定程度上降低高寒地区指战员因寒冷造成非战斗减员，提高我军高寒地域的作战能力[6-7]。

1 仪器与试药

1.1 仪器

冰柜（海尔电冰柜，BC/BD-272SE）；自制小鼠足体积测量仪；激光多普勒仪（Perimed，PF5002，Periflux system 5000）；电子分析天平（120D型，北京岛津公司）。

1.2 试药

肌醇烟酸酯（天津中瑞药业有限公司，批号：130702）；肝素钠（河北常山生化药业股份有限公司，批号：01130509，效价：199.4 U/mg）；轻质液状石蜡（湖南尔康制药股份有限公司）；羊毛脂（上海洲辉羊毛脂有限公司）；白凡士林（包头昆仑石化有限公司）；单硬脂酸甘油脂（湖南尔康制药股份有限公司）；十六醇（国药集团化学试剂有限公司）；司盘80（南京威尔化工有限公司）；氮酮（国药集团化学试剂有限公司）；羟苯乙酯（台山市新宁制药有限公司）；聚山梨酯80（湖南尔康制药股份有限公司）；以上试剂均为药用标准或分析纯；肝素钠肌醇烟酸酯乳膏（沈阳军区总医药药剂科自制，每支20 g，批号：20140820、20140925、20141018）；水为纯化水；其他试剂均为分析纯。endprint

1.3 动物

昆明种小鼠：雄性，6～8周，体重25～27 g，由沈阳军区总医院动物实验科提供[合格证号：SCXK（京）2012-0001]；SD大鼠：雄性，45～60 d，体重180～200 g，由沈阳军区总医院动物实验科提供[合格证号：SCXK（辽）2010-0001]；饲养环境：室温20～25℃，湿度40%～60%，自由飲食饮水，适应性饲养7 d后用于实验。

2 方法与结果

本研究选用预防冻伤小鼠足肿胀实验和预防冻伤大鼠局部激光多普勒血流灌注量实验作为药效筛选模型，以肝素钠、肌醇烟酸酯和促透剂氮酮为考察因素，以足肿胀抑制率和血流灌注量为药效评价指标，采用Design-Expert软件中的星点设计法对各组实验数据进行效果验证。

2.1 预防冻伤小鼠足肿胀实验

取健康昆明种小鼠170只，雌雄各半，按体重随机分成17组，每组10只，分别为：模型组和16个不同配比给药组。造模前1.5 h，除模型组外，其余各给药组使用第1～16组乳膏均匀涂抹小鼠的四肢，1.5 h内均匀涂抹2次。将小鼠放入-18℃冰柜中冷冻25 min，取出，造模完成。于给药前和造模后4 h测量每只小鼠左、右后肢体积，记录小鼠足肿胀程度并计算左、右后足肿胀之和的肿胀抑制率。

2.2 预防冻伤大鼠激光多普勒血流灌注量实验

取健康SD大鼠102只，雌雄各半，按体重随机分成17组，每组6只，分别为：模型组和16个不同配比给药组。造模前1.5 h，除模型组外，其余各给药组使用第1～16组乳膏均匀涂抹大鼠的四肢，1.5 h内平均涂抹2次。将大鼠放入-18℃冰柜中冷冻80 min，取出，造模完成。各组于给药前和造模后4 h均采用激光多普勒灌注测量仪测定右后足的血流灌注量，并进行统计学分析。

2.3 星点设计优化方法

根据星点设计的原理[8-10]，本试验对肝素钠、肌醇烟酸酯和氮酮三个因素进行考察，每个因素设五水平，用代码值-α，-1，0，1，α（α=1.68）表示，因素水平详见表1，试验安排如表2中1～16中肝素钠肌醇烟酸酯乳膏（20 g）各处方组成所示，结果详见表2。

2.4 模型的预测、拟合与最优处方配比

本研究分别以足肿胀抑制率Y1和血流灌注量Y2，肝素钠X1、肌醇烟酸酯X2、氮酮X3为自变量，对各因素进行多元线性回归和二项式拟合[11-13]，多元线性回归相关系数r约为0.6，其相关性较差，拟合度不佳，对实验结果的预测性较差，而二项式拟合的相关系数均大于0.98，拟合度较佳，得二项式方程为：

Y1 = 68.03+8.84X1+1.82X2+2.44X3+2.27X1X2+5.00X1X3+2.28X2X3-6.86X12-4.11X22-6.42X32（P < 0.01，r = 0.98）。

Y2 = 53.15+5.55X1+1.97X2+1.26X3+1.70X1X2+3.27X1X3+2.45X2X3-5.89X12-3.01X22-4.68X32（P < 0.01，r = 0.97）。

2.5 效应面分析

根据优化后的二项式拟合方程，把因变量与两个因素拟合为三维曲面图，应用Design-Expert 7.0软件做出三维效应图，从而在效应面最佳区域上选取相应因素的较佳水平作为试验条件[14-15]，三维效应面图和等高线图详见图1～6。

从足肿胀实验输出结果可知，肝素钠、肌醇烟酸酯和氮酮均P < 0.05，说明三者对冷冻后足肿胀均有良好的抑制作用，且肝素钠P < 0.01，说明肝素钠作用更显著。从响应面和等高线图可以看出，肝素钠和肌醇烟酸酯有一定的药物协同作用，量效存在平台现象；肝素钠浓度低时，药效随氮酮浓度先升后降。肝素钠浓度高时，药效随氮酮浓度升高，也具有一定的协同作用。

从大鼠足部血流灌注量实验输出结果可知，肝素钠、肌醇烟酸酯和氮酮均P < 0.01，说明三者对冷冻后足部血流均有显著的促进作用，AB、AC和BC均P < 0.05，三者之间均有一定的协同作用。从响应面和等高线图可以看出，肝素钠和肌醇烟酸酯有较强的药物协同作用，药效随药物浓度的增加均呈现先升后降的趋势。

通过足肿胀和血流量实验的等高线图，选取肝素钠、肌醇烟酸酯和氮酮药效较佳范围为6500～8500 U、肌醇烟酸酯200～300 mg、氮酮500～650 mg，考虑到肝素钠肌醇烟酸酯乳膏制剂的稳定性、有效性和安全性等因素，及结合生产成本和可操作性等实际条件，最终试验选取处方（20 g）药物的较佳配比为：肝素钠8000 U，肌醇烟酸酯200 mg和氮酮600 mg。

3 讨论

在乳膏剂的处方中，氮酮为目前使用较多的促透剂，用量小，无毒且对皮肤的刺激性很低，对亲水性或疏水性化合物均有较强的透皮吸收促进作用，通过文献调研发现氮酮对不同药物的透皮吸收影响不同、其用量并非越高越好，故本实验除了筛选主药的最优配比外，也考察了促透剂氮酮对试验药物的最佳用量[16-20]。

本实验在处方筛选过程中，考虑过现在使用比较成熟的均匀设计和正交实验设计方法，但这两种实验的精度不够，选择的试验取值仅仅是接近最佳取值，无法精确找到最佳点；条件优选凭经验，不能灵敏地考察各因素间的交互作用等等。鉴于以上问题，最后选择了国内外近半年来常用集数学和统计学方法于一体的星点设计效应优面法进行试验设计[21-24]，它具有试验次数小，试验精度高等特点，它通过描绘效应考察因素的效应面，从效应面上选择较佳的效应区，从而回推出自变量取值范围，即最佳实验条件，适用于本实验。

[参考文献]

[1] 张石革，龙振华.冻伤（疮）与用药防护[J].中国药房，2003，14（12）：767-768.endprint

[2] 高彩平，孙占军.肝素钠注射液临床新用途[J].中国药师，2006，9（8）：764-765.

[3] 高胜旗.肝素钠乳膏治疗冻伤[J].食品与药品，2005，7（11）：69-70.

[4] 宋永熙.肝素鈉软膏的作用机制及临床应用[J].食品与药品，2005，7（8）：55-56.

[5] 侯兆明.中药外洗联合复方乳酸乳膏和肝素钠乳膏外涂治疗手足皲裂60例[J].中国中西医结合皮肤性病学杂志，2012，11（3）：177.

[6] 韩运梅，林立，张春之.低温对机体损伤作用的研究进展[J].中国职业医学，2008，35（6）：515-517.

[7] 郭强，杨龙江.某部新兵集训期间冻伤的防治体会[J].中国实用医药，2009，4（2）：217-218.

[8] 程勐，刘美，闫碧涵，等.星点设计-效应面法优化多烯磷脂酰胆碱注射液的处方[J].华西药学杂志，2014，29（6）：625-627.

[9] 叶海娜，张爱玲，何雁，等.星点设计-效应面法优选妇糜康凝胶剂的基质处方[J].中国实验方剂学杂志，2014，20（16）：19-22.

[10] 冉茂莲，李小芳，罗丽佳，等.星点设计-效应面法优选罗布麻叶总黄酮提取工艺 [J].成都中医药大学学报，2014， 37（4）：4-7.

[11] 谢顺岚，吴方建.星点设计-效应面法优化姜黄素提取工艺[J].中国医药导报，2016，13（33）：125-128.

[12] 侯晓军，唐菱，周芃，等.星点设计-效应面法优化硼酸乳膏基质配方及质量控制 [J].中国药师，2016，19（5）：879-883.

[13] 部娜，王承志.星点设计-效应面法优化雄黄乳膏剂的处方组成[J].中成药，2016，38（4）：930-934.

[14] 伍勇，贺福元，曹燕，等.星点设计-效应面优化法对四物汤醇沉工艺的研究[J].中国医药导报，2009，6（3）：17-19.

[15] 张纪兴，何雯，梁福尧，等.八味痛风康微丸处方的星点设计-效应面法优化[J].中国医药工业杂志，2010，41（9）：674-677.

[16] 寿张轩.氮酮应用研究进展[J].中国药业，2002，11（8）：73-74.

[17] 宇克莉，孙建华.几种透皮吸收促进剂的作用机制探讨[J].山东医药，2007，47（11）：30-31.

[18] 林桂涛，盛华刚，张超，等.复方蟾酥镇痛巴布膏剂体外透皮吸收研究[J].中国实验方剂学杂志，2011，17（9）：1-3.

[19] 刘海燕，黄志军，梁颖，等.常用透皮吸收促进剂对盐酸西替利嗪经皮渗透性能的影响[J].中国药房，2016，27（1）：41-43.

[20] 车选义，李裕钦，王建萍，等.氮酮对低分子量肝素钠离体大鼠皮肤透皮吸收的研究[J].中国医药导报，2013， 10（32）：7-9.

[21] 刘艳杰，项荣武.星点设计效应面法在药学试验设计中的应用[J].中国现代应用药学，2007，24（6）：455-457.

[22] 邱颖，朱玲，孙晓英.星点设计-效应面优化法与正交设计和均匀设计的比较及其在药剂研究中的应用[J].海峡药学，2011，23（2）：18-20.

[23] 王永菲，王成国.响应面法的理论与应用[J].中央民族大学学报，2005，14（3）：236-240.

[24] 施昶，沈诗偲，黄海飞，等.星点设计-效应面优化法在处方筛选和优化中的应用[J].中国制药装备，2014，32（422）：41-46.

（收稿日期：2017-04-27 本文编辑：苏 畅）endprint