关于考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度实验的误差分析与改进

2017-10-25毛伍祥

课程教育研究 2017年38期

关键词：比色法

【摘要】本文对传统的考马斯亮蓝测定蛋白质浓度的方法存在的问题进行了探讨，并从减少实验误差的前提下对实验细节进行了改进，并使该实验成为设计严谨、操作简便、数据可靠的生物化学实验。

【关键词】蛋白质浓度比色法考马斯亮蓝

【中图分类号】G64 【文献标识码】A 【文章编号】2095-3089（2017）38-0248-01

考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度是生物化学中的经典实验，是利用蛋白质-染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。

1.考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度实验的基本原理

考马斯亮蓝G250的磷酸溶液呈棕红色，最大吸收峰在465nm处。当与蛋白质结合时，溶液变成蓝色，其最大吸收峰变为595nm，并且考马斯亮蓝G250-蛋白质复合物的高消光效应导致了蛋白质定量分析的高灵敏度。

依据朗伯-比尔定律，在一定浓度范围内，考马斯亮蓝G250-蛋白质复合物的吸光度与蛋白质含量呈线性关系，其关系式为：A=kbC复合物，式中，A为吸光度，k为摩尔吸光系数，b为吸收层厚度，C复合物为考马斯亮蓝G250-蛋白质复合物的浓度。

如下图表格所示，取8支干净试管，并编号0-7。其中0号试管作为空白对照；1-6号试管按下表配方依次添加各种试剂，包括不同浓度的标准蛋白溶液；7号试管装有未知蛋白液样品。按比例混匀后，室温静置3min，于波长595nm处测得8支试管的吸光度值。取0-6号试管的吸光度值，以吸光度为纵坐标，各标准蛋白液浓度（ug/ml）为横坐标作图，绘制标准曲线；再根据标准曲线计算出考马斯亮蓝G250-蛋白质复合物的摩尔吸光系数k=A/bC复合物；最后将7号试管中未知蛋白液的吸光度代入公式C復合物=A/kb，即得求得蛋白质浓度。

2.实验中存在的问题

（1）该实验需要使用可见光分光光度计完成比色测定，学生初次使用可见光分光光度计进行比色测定，操作技术和流程不够熟悉，耗时较长，往往不易获得好的数据。

（2）该实验中所使用的试剂，例如：考马斯亮蓝溶液、标准蛋白液、NaCl溶液等等，以及纯水中存在着残留蛋白质，也会对实验造成干扰，影响标准曲线的绘制结果。

（3）该实验中，0号试管中没有加入任何蛋白液，作为空白组，理论上吸光度值为零，而实际测量中，由于溶液中残留的蛋白质、吸收池以及仪器的系统误差影响等，即使不加蛋白液，也存在着一定的可见光吸收，与朗伯-比尔定律计算公式A=kbC复合物的理论值不一致，从而造成标准曲线的绘制误差。

（4）依据朗伯-比尔定律理论，溶液的浓度会导致定律发生偏离，即仅在一定浓度范围内，考马斯亮蓝G250-蛋白质复合物的吸光度与蛋白质含量呈线性关系。

（5）在未知蛋白液的吸光度测量时，只有一个样本，受系统误差和人为误差影响较大。

3.实验的改进及解决方法

（1）给可见光分光光度计配备多联池（最好六个样品池），待绘制标准曲线时，仅需1次完成比色测定，大大提高检测效率，并且6个不同浓度的标准品溶液几乎同时测定，可消除考马斯亮蓝G250-蛋白质复合物的凝集沉淀影响。

（2）该实验中所提到的试剂配制，例如：考马斯亮蓝溶液、标准蛋白液、NaCl溶液等等，以及所用到的纯水均采用重蒸水，可最大限度的降低残留蛋白质对本实验的干扰。

（3）绘制标准曲线时，以0号试管（不加入任何蛋白质样品）作参照，当不加任何蛋白质溶液时，手动设置吸光度值为零。在此基础上，再测量标准蛋白液（1-6号试管）和未知蛋白液的吸光度值，从而尽可能减少对标准曲线绘制的影响。

（4）在测定未知蛋白液的蛋白质浓度时，可安排两次完成。第一次测定时，依据标准曲线计算出未知蛋白液中蛋白质浓度的大致数值；第二次测定时依据标准曲线的良好线性范围，对未知溶液作适当的稀释，使之处于测量的最佳浓度范围，从而获得较为精确的数值。

（5）未知蛋白液准备三份，分别测定，最后取平均值，以尽可能减小系统误差和人为误差。