针刺结合游泳训练对大脑中动脉缺血再灌注大鼠认知功能的影响

崔佳雯+++马书杰++褚立希

[摘要] 目的 探討针刺百会穴结合游泳训练对大脑中动脉缺血再灌注大鼠认知功能的影响。 方法 将SD大鼠手术制成右侧大脑中动脉缺血再灌注模型，将手术模型成功后的28只大鼠进行神经功能评定及水迷宫测试后按照随机数字表分为模型组、针刺组、游泳组和针游结合组，每组7只；另设假手术组7只。假手术组及模型组不给予任何治疗；针刺组给予百会穴针刺治疗，1次/d；游泳组给予游泳训练，1次/d；针游结合组给予针刺百会穴结合游泳训练，1次/d。共治疗6 d。每天治疗前测量体重进行神经功能评分，治疗6 d后进行水迷宫测试其学习记忆能力，测试结束取脑，采用TUNEL染色观察海马区细胞凋亡情况。 结果 治疗后针刺和游泳治疗无明显交互作用（P > 0.05），但针游结合组大鼠神经功能评分低于模型组（P < 0.05）；针游结合组大鼠水迷宫穿越平台次数多于模型组（P < 0.05）。 结论 针刺结合游泳训练对于大脑中动脉缺血再灌注大鼠认知功能的影响可能优于单纯针刺或游泳，需要更深入的研究探索。

[关键词] 大脑中动脉缺血再灌注；大鼠；针刺；游泳训练；Morris水迷宫；海马区；细胞凋亡

[中图分类号] R743.5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）09（b）-0025-04

The influence of acupuncture combined with swimming training for the cognitive function in middle cerebral artery ischemia-reperfusion rats

CUI Jiawen MA Shujie CHU Lixi

College of Rehabilitation Medicine， Shanghai University of Traditional Chinese Medicine， Shanghai 201203， China

[Abstract] Objective To observe the influence of acupuncture combined with swimming training for the cognitive function in middle cerebral artery ischemia-reperfusion rats. Methods SD rats were made into the model of right middle cerebral artery ischemia-reperfusion. After evaluation of neurological function test and water maze test operation， the 28 successful model rats were divided into model group， acupuncture group， swimming training group， and integrated acupuncture and swimming training group by random number table， with 7 rats in each group， 7 rats of sham-operation group were set separately. There was no treatment for sham-operation group and model group， the acupuncture group was given acupuncture therapy on GV 20， once per day， while the swimming training group was given swimming training， once per day， and integrated acupuncture and swimming training group was given integrated acupuncture therapy on GV 20 and swimming training， once per day. Total treatment time was 6 days. Each day before treatment， weight and neural functional test were evaluated. After treatment for 6 days， water maze test was detected for the ability of learning and remembering， after all treatment and evaluation， the brains were taken， then TUNEL staining was used to observe the cell apoptosis in hippocampus. Results After treatment， there was no interactive effect between acupuncture and swimming training （P > 0.05）， the neural function score of integrated acupuncture and swimming training group was lower than that of model group （P < 0.05）， the number of step through in water maze test of integrated acupuncture and swimming training group was more than that of model group （P < 0.05）. Conclusion The influence of acupuncture and swimming training for the cognitive function in middle cerebral artery ischemia-reperfusion rats may be better than acupuncture or swimming training only， more research needs to be done in the future.endprint

[Key words] Middle cerebral artery ischemia-reperfusion； Rats； Acupuncture； Swimming training； Morris water maze； Hippocampus； Cell apoptosis

研究表明，脑卒中后认知功能障碍的发生率可达72.5%[1]。脑卒中患者的认知功能可以提高患者的理解力和执行力，从而提高康复效益[2]。因此脑卒中后的认知功能损害越来越受到重视，同时也已成为神经科学领域当前研究发展的重点[3]。Quaney等[4]研究表明有氧运动能提高脑卒中患者的信息处理速度、运动学习能力、内隐记忆和运动功能。针灸可通过改善血液流变性障碍、调节中枢胆碱能递质、调节神经肽、调节血管活性物质功能、清除自由基、阻止细胞凋亡、保护神经元等途径改善患者认知功能[5-7]。针刺配合康复训练能够改善脑卒中后认知障碍，降低血浆皮质醇含量，且疗效优于尼莫地平治疗[8]。本研究主要探讨针刺结合有氧运动对脑卒中大鼠认知功能的影响，为更深入的认知改善机制的研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

选取健康雄性200～220 g SD大鼠，手术制成右侧大脑中动脉缺血再灌注模型，将手术模型成功后的28只大鼠进行神经功能评定及水迷宫测试后，采用数字随机法将其分为模型组、针刺组、游泳组和针游结合组，每组7只；另设假手术组7只。

模型组大鼠术后饲养于普通鼠笼，不予任何治疗；游泳组于水迷宫评估后1 d开始每天给予1次游泳训练；针刺组于水迷宫评估后1 d开始每天给予1次百会穴针刺治疗；针游结合组于水迷宫评估后1 d开始每天针刺百会穴结合游泳训练1次，各组均治疗6 d。

1.2 主要试剂及仪器

材料：云龙牌无菌针灸针0.25 mm×25 mm：吴江市云龙医疗器械有限公司。试剂：10%水合氯醛：上海国药集团（批号：20160427）；原位末端转移酶标记染色（TUNEL）试剂盒：Roche公司（批号：11684817910）。仪器：Morris水迷宫（Morris-water-maze，MWM），包括水池和站台、CCD摄像头、视频采集卡、MWM视频分析软件（货号：DigBehv001动物行为分析系统）：上海吉量软件科技有限公司产品；正置显微镜：OLYMPUS公司（型号：CX41）；IMS图像分析系统：基尔顿生物科技（上海）有限公司。

1.3 动物模型制作

大鼠仰卧固定于实验台上，10%水合氯醛腹腔注射麻醉（0.35 mL/100 g），用改良的Zea Longa's线栓法[9]阻断大鼠右侧大脑中动脉制作大脑中动脉缺血再灌注局灶性脑缺血模型，2 h后拔去線栓再灌注。模型制作24 h取脑，切片，以TTC染色证明造模方法的有效性[10]。将神经功能评分为1、2、3分的大鼠纳入实验研究，0、4分大鼠予以剔除。

1.4 神经功能评分

参照Longa等[9]推荐的5分法对再灌注1 d的模型大鼠进行评分：0分：无神经损伤；1分：不能完全伸展对侧前爪；2分：向栓塞对侧转圈；3分：向栓塞对侧倾倒；4分：不能自发行走，意识丧失。

1.5 Morris水迷宫测试

于治疗前后对各组大鼠进行水迷宫测试[11]。MWM为直径160 cm、高50 cm的圆形水池，池壁黑色，水深23 cm，水温保持在（22±2）C°，在第Ⅳ象限距池壁35 cm处放置直径为9 cm的圆形黑色站台，站台位于水面下2 cm，试验前水中加入适量碳素墨汁，使大鼠无法看到水面以下平台。室内温度高于水温5 C°以上，光照恒定，无光线直射池内，分别予定位航行试验，记录大鼠从入水至找到平台所用时间（逃避潜伏期）；以及去掉平台后的空间探索试验，记录大鼠在原平台处穿越次数。

1.6 针刺百会穴

根据相关文献[12-13]选取百会。方法：百会穴向后斜刺2 mm，留针20 min，共治疗6 d。

1.7 游泳训练

取一边长为1 m的正方体容器，水位50 cm，将游泳组及针游结合组大鼠置于其中游泳20 min，各治疗6 d。

1.8 TUNEL染色

取材固定后，将其洗涤、脱水、透明、浸蜡包埋、切片后进行TUNEL染色，具体流程如下：①脱蜡：65℃、30 min；二甲苯Ⅰ 10 min、二甲苯Ⅱ 10 min；②水化：将脱蜡后的切片经100%乙醇、95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇、双蒸水各3 min；③消化：将玻片浸入胰蛋白酶内消化40 min，PBS洗3 min×3次；④制备TUNEL反应混合液；⑤加50 μL TUNEL反应混合液于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37℃反应1 h；PBS洗3 min×3次；⑥加50 μL POD于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37℃×30 min，PBS洗3 min×3次；⑦DAB染色3～10 min，自来水冲洗，苏木精复染，1%盐酸酒精分化，显微镜下观察，控制染色程度；⑧脱水：75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、100%乙醇，逐级脱水，各3 min；⑨透明：二甲苯透明3 min×2次；⑩中性树胶封片。最后通过200×显微镜采集分析样本，计算凋亡率，被染为深棕色的为凋亡细胞，正常细胞很少能够被染色。

1.9 统计学方法

采用SPSS 24.0版统计学软件包进行统计分析，数据用均数±标准差（x±s）表示，两组计量资料采用独立样本t检验，多组计量资料采用完全随机方差分析，各组治疗后各计量资料采用2×2析因设计的方差分析。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 实验结束后动物存亡数endprint

实验结束后，假手术组动物7只，死亡0只；模型组动物剩余6只，死亡1只；针刺组动物5只，死亡2只；游泳组动物6只，死亡1只；针游结合组动物5只，死亡2只。

2.2 治疗前假手术组和模型组各项指标比较

治疗前假手术组和模型组神经功能评分、WMW逃避潜伏期和穿越平台次数比较，差异均有统计学意义（P < 0.05），证明造模成功。见表1。

2.3 治疗前各手术组各项指标比较

治疗前模型组、针刺组、游泳组及针游结合组神经功能评分、WMW逃避潜伏期和穿越平台次数比较，差异均无统计学意义（P > 0.05），提示各手术组治疗前基线一致。见表2。

2.4 治療后各组间各项指标比较

治疗后，模型组（不使用针刺和游泳）样本量为6只，针刺组（使用针刺不使用游泳）样本量为5只，游泳组（不使用针刺使用游泳）样本量为6只，针游结合组（使用针刺使用游泳）样本量为5只。模型组、针刺组、游泳组及针游结合组神经功能评分、WMW逃避潜伏期和穿越平台次数比较，无交互影响。见表3～6。

2.5 治疗后模型组和针游结合组各项指标比较

模型组与针游结合组各项指标比较，神经功能评分及穿越平台次数差异有统计学意义（P < 0.05），提示针游结合组治疗后存在一定的阳性趋势。见表7。

2.6 治疗后TUNEL染色所示各组海马区细胞凋亡情况

治疗后假手术组、模型组、针刺组、游泳组及针游结合组海马区TUNEL染色后放大200倍的情况，被染为深棕色的为凋亡细胞，未被染色的为正常细胞，根据染色情况而计算出凋亡比率。见图1（封三）。

3 讨论

针刺治疗可改善卒中后抑郁大鼠的空间学习记忆能力，提高卒中后抑郁大鼠模型海马区脑源性神经营养因子（BDNF）水平[14]；电针对提高脑卒中后大鼠认知功能和减少梗阻面积具有显著疗效[15]，其中电针百会、神庭穴等能通过调节B淋巴细胞瘤-2基因以及相关X蛋白有显著改善认知的效果[16]。有氧运动对提高脑卒中患者认知能力，尤其对于记忆、注意和视觉空间认知有一定的效果[17]；有动物实验证实，中强度有氧运动对于认知测试有实际疗效[18]。早期针灸联合康复治疗方案可提高老年脑卒中患者的治疗效果，促进患者认知功能和日常生活能力的提高[19]；针灸结合康复治疗对脑卒中后的认知障碍有交互作用[20]。我们希望通过基础实验的研究找到针刺结合有氧运动改善脑卒中患者认知障碍的基本机制，为临床治疗提供可资参考的依据。

本实验虽然由于各组均有实验动物的死亡而致样本量不足，通过双因素的方差分析没有明显差异，但各项指标的均值还是存在着阳性趋势，说明针游结合有较单纯针刺及单纯游泳更佳疗效的趋势。针游结合组和模型组间治疗后神经功能评分和穿越平台次数有显著差异，说明针游结合确实具有一定疗效，而其与单纯针刺和单纯游泳的疗效对比仍需待进一步研究探索。

本研究认为针游结合组对于大脑中动脉缺血再灌注大鼠认知功能的影响可能优于单纯针刺或单纯游泳组，此种方法可以在今后的实验中扩大样本量，继续深入探索。

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（收稿日期：2017-05-22 本文编辑：张瑜杰）endprint