一种新型肝细胞癌分子靶向治疗临床药敏检测方法的建立

孙慧伟，柴燕涛，赵爽，王志杰，谢辉，洪志贤，冯帆，侯俊

解放军第三〇二医院 a.临床研究管理中心；b.介入科；c.肝胆外科一中心；北京 100039

一种新型肝细胞癌分子靶向治疗临床药敏检测方法的建立

孙慧伟a，柴燕涛a，赵爽a，王志杰a，谢辉b，洪志贤c，冯帆a，侯俊a

解放军第三〇二医院 a.临床研究管理中心；b.介入科；c.肝胆外科一中心；北京 100039

目的：建立分子靶向药物索拉菲尼（Sorafenib）临床治疗肝细胞癌（HCC）敏感性的新型预测方法。方法：将HCC手术切除癌症标本外围组织性状较好的部分处理成1 mm3，原位接种于免疫缺陷的BALB/c小鼠肝脏，4～6周后B超检测其生长状况；当肿瘤长至2～3 mm3时，用生理盐水配置Sorafenib溶液，以2 mg/kg用量对小鼠进行隔日口服灌胃给药，共给药10次。最后收集动物，观察肝脏原位肿瘤的大小，同时进行病理检测，考察Sorafenib的抗肿瘤治疗效果。结果：实验动物肝脏拍照和病理结果均显示，与溶剂对照组相比，Sorafenib治疗组小鼠肝脏原位HCC病灶明显缩小或消除。结论：建立了HCC分子靶向治疗临床药敏检测方法，为临床有效且个体化治疗HCC提供了新途径。

肝细胞癌；分子靶向治疗；免疫缺陷动物；原位肿瘤模型；药敏检测

我国逾8000万人携带乙型肝炎病毒（HBV）或罹患乙肝，随着疾病的进展，有相当比例的患者最终发展为肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）[1]。由于大部分HCC患者初诊即为进展期，失去肝移植或外科手术等根治性治疗的机会，因此抗肿瘤药物治疗对于HCC临床诊疗具有重要意义[2]。但HCC具有对细胞毒性化疗药多药耐药（multi-drug resistance，MDR）的特性，目前进展期HCC患者惟一的一线治疗药物是口服多靶点小分子蛋白激酶抑制剂（分子靶向药物）索拉菲尼（Sorafenib）。尽管Sorafenib治疗组HCC患者总体生存期（over survival，OS）或疾病进展时间（time to progression，TTP）均较安慰剂组明显延长[3-8]，但Sorafenib总体有效率仍较低，仅为26%～43%[9-10]。这表明进展期HCC患者对Sorafenib的敏感性存在明显的个体差异，且Sorafenib治疗过程中也有可能出现药物耐受。因此，建立Sorafenib治疗HCC的敏感性预测方法具有重要的临床意义。

1 材料与方法

1.1 材料

HCC手术切除标本由解放军第三〇二医院肝胆外科一中心一科提供，患者接受降阶梯治疗（射波刀）行为评分提高后接受外科手术切除治疗。病人手术切除标本后立即放入含20%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基的50 mL无菌离心管中，尽快送入实验室进行后续实验。

BALB/c免疫缺陷小鼠由北京斯贝福公司提供；HepG2细胞为本实验室保存，以高糖DMEM培养基（Hyclone公司）添加10%FBS（Hyclone公司）培养；Sorafenib为Selleck公司产品；H&E染色试剂盒为北京中杉金桥公司产品；小鼠手术器械与缝合针线、吸入麻醉剂异氟烷等为本实验室保存。

1.2 利用HepG2细胞系建立HCC肝脏原位肿瘤

HepG2细胞培养至指数增长期，待其状态良好后接种于免疫缺陷动物皮下（腋下接种，每个接种点为1×106细胞），生长6～8周形成明显的皮下肿瘤，解剖动物获得肿瘤，剥取肿瘤组织实表面/边缘性状较好的部分（包括肿瘤组织色泽较好并伴有丰富血管的部分），切碎形成组织微块（直径0.5～1 mm），保存于含20%FBS的DMEM培养基中。BALB/c免疫缺陷小鼠用异氟烷进行持续吸入麻醉，将小鼠固定并行开腹手术，在其肝右叶用眼科镊制造孔洞，将前述肿瘤组织微块种植于肝右叶孔洞中，摁压止血后将肝叶小心推回小鼠腹腔，小心缝合肌肉与皮肤，避免伤及内脏。生长6～8周后B超探查病灶（直径2～3 mm），解剖动物，比较B超探查结果与实际大小的差异。

1.3 病理学检测

前述获得的免疫缺陷动物剥离肝右叶，切取肿瘤，用4%多聚甲醛固定24 h后进行病理石蜡包埋、切片等常规操作。HE染色切片石蜡切片依次处理脱蜡复水后，苏木精液染色约1 min，用1%盐酸乙醇分化30 s，最后用伊红液染色。切片脱水后用中性树胶封片。显微镜下观察肿瘤组织的特性并拍照。

1.4 免疫缺陷小鼠HCC原位肿瘤种植

选取HCC患者手术切除标本外围性状较好的部分分解为肿瘤组织微块（直径约0.5 mm），保存于含20%FBS的DMEM培养基中，准备裸鼠的肝脏原位移植。随后将BALB/c免疫缺陷小鼠用异氟烷进行持续吸入麻醉，将小鼠四肢固定并行开腹手术，在其肝右叶用眼科镊制造孔洞，将处理好的肿瘤组织微块种植于肝右叶孔洞中，摁压止血后将肝叶小心推回小鼠腹腔，小心缝合肌肉与皮肤，避免伤及内脏。

1.5 B超检测免疫缺陷小鼠HCC原位肿瘤模型

种植肿瘤组织微块的裸鼠生长4～6周后，B超探查其肝脏原位肿瘤的生长情况。当B超显示有1～2 mm直径低回声病灶时，可认为形成了明确的肝脏原位肿瘤。

1.6 小鼠分子靶向治疗

用生理盐水配置Sorafenib溶液，按2 mg/kg对小鼠隔日口服灌胃给药（生理盐水口服灌胃为对照），共给药10次（18 d）。末次口服灌胃给药后2～3 d收集动物，观察肝脏原位病灶的大小并进行HE染色，评价Sorafenib的抗肿瘤治疗效果。

2 结果

2.1 HepG2细胞免疫缺陷小鼠肝脏原位模型构建

用B超探查与病理学方法（HE染色）检测HepG2细胞免疫缺陷小鼠肝脏原位模型。接种了HepG2皮下肿瘤组织微块的免疫缺陷小鼠，6～8周后B超探查发现其肝脏有明确的病灶信号（图1）；解剖动物后，其肝脏原位病灶清晰可见（图2A），HE染色进一步验证了肿瘤的特异性（图2B）。表明建立了HepG2细胞免疫缺陷小鼠肝脏原位模型。

2.2 HCC手术切除标本免疫缺陷小鼠肝脏原位模型构建

在前述基础上，对8只免疫缺陷小鼠进行源于同一患者的HCC肝脏原位种植手术，术后饲养4周，随机挑选其中1只进行B超检查，处死后进行病理分析确证，检测。结果如图3所示，B超探查显示小鼠肝脏有明显低回声的病灶（图3A中白色圆圈标识的阴影），直径1～1.5 mm，与将裸鼠处死后解剖的癌组织大小一致，HE染色结果也验证了肝脏原位肿瘤B超检测的特异性（图3B），表明可以用B超初步判断肿瘤组织在体内的生长。上述实验结果表明，我们成功地利用HCC患者手术切除标本种植免疫缺陷动物肝脏，建立了肝脏原位模型。

图1 HepG2免疫缺陷动物肝脏原位肿瘤模型的B超探查

图2 HepG2免疫缺陷动物肝脏原位肿瘤与病理学检测

图3 HCC免疫缺陷动物肝脏原位肿瘤模型的B超检测结果

2.3 Sorafenib治疗敏感性检测

将B超扫描确认的6只具有肝脏原位肿瘤的小鼠分成2组（每组3只），分别进行Sorafenib和生理盐水口服灌胃给药。经过18 d治疗，最终获得5只动物的实验结果（对照组1只小鼠因过于衰弱死亡）。由于最终只剩2只对照组小鼠，因此显示2 v.s.2的结果照片。结果显示（图4），2只对照组小鼠肝脏均有明确的HCC病灶（图4A、B）。在剥取肝组织过程中也发现，2只小鼠肝叶上HCC病灶的恶性程度均较高，其生长造成了不同肝叶之间的黏连和侵袭，而Sorafenib治疗组动物肝脏表面病灶明确缩小或消失。由此表明Sorafenib治疗该例病人的HCC有效，Sorafenib具有明确的抗肿瘤活性，几乎能够消融肿瘤病灶（图4C、D）。进一步进行病理学确证，HE染色结果显示HCC患者切除标本在免疫缺陷动物肝脏右叶形成明确病灶，造成严重的肝损伤（图5A、B），接受Sorafenib治疗的动物肝脏无明显病灶（图5C、D），证实了Sorafenib的抗肿瘤活性。

图4 Sorafenib对HCC原位肿瘤的抑制活性检测

图5 Sorafenib对HCC原位肿瘤的抑制活性检测的病理检测确认

3 讨论

HCC具有对传统细胞毒性化疗药物的MDR特性，因此在临床诊疗中患者无法从常规化学药物治疗（口服或静脉滴注化疗药物）中获益[11]。尽管射波刀（Cyber knife）等物理性治疗策略能够在一定程度上局部消融HCC病灶[12]，以及动脉化疗栓塞（transarterial chemoembolization，TACE）能够利用奥沙利铂（Oxaliplatin）、表柔比星（Epirubicin）或雷替曲塞（Raltitrexed）等化疗药物进行降阶梯治疗[13]，减轻患者肿瘤负荷，提高患者行为评分，但这些治疗策略也存在造成HCC复发或转移的风险，因此研究和建立HCC新的诊疗策略具有重要意义。目前治疗HCC的惟一一线药物Sorafenib总体有效率为25%～40%，如何确定Sorafenib治疗有效的个体，减轻病人的治疗负担，从而达到药物的精准治疗，是医务人员常常思考的问题。因此，建立HCC分子靶向治疗敏感性检测方法具有特殊的临床意义。

本研究目的为建立HCC相关药物敏感性检测方法。在前期实验中，我们用HepG2肝癌细胞注射裸鼠皮下，长出细胞系癌块后用组织块肝脏原位移植手术将其从裸鼠皮下取出，切碎后重新植入裸鼠肝脏，建立了组织块肝脏原位移植技术。我们利用该技术，将患者手术切除的肝癌组织经切碎处理后直接植入裸鼠肝脏，从而构建了癌症组织肝脏原位移植的动物模型。随后，对裸鼠进行Sorafenib分子靶向药灌胃治疗，实验结果表明该患者标本中的HCC细胞对Sorafenib敏感，表明该患者可能对Sorafenib敏感，术后有可能通过服用Sorafenib预防复发与疾病进展。通过对其行为评分和诊疗过程进行追踪分析，发现该患者入院确诊时行为评分较差，因此先行射波刀和TACE降阶梯后方接受外科手术切除。现已有明确报道，射频消融、TACE或射波刀等局部消融策略结合Sorafenib治疗能够显著延长患者生存期，提高患者生存质量[9-10,14]。本研究结果与这些报道一致，这提示局部消融的物理性治疗策略有可能改变患者HCC细胞的生物学行为或特性，增加其对Sorafenib的敏感性。但另一方面，射波刀和TACE等也有可能改变HCC病灶的生物学行为，使其对Sorafenib敏感或易于复发，而HCC降阶梯治疗后的复发风险也值得警惕[11,15]。

本研究建立了一种新型Sorafenib治疗HCC的临床药敏检测方法，利用免疫缺陷小鼠建立HCC肝脏原位肿瘤模型，行口服灌胃给药治疗后能够明确观察到Sorafenib对HCC原位病灶的抗肿瘤活性。该方法具有自身独特的优势：①在建立细胞系过程中，HCC细胞的性状或生物学行为会发生变化，可能难以反映HCC临床治疗的实际情况。在研究中我们也发现，利用HCC较为常见的细胞系HepG2先建立皮下肿瘤模型，再将肿瘤组织微块接种于免疫缺陷小鼠肝脏获得的HCC模型与HCC手术切除标本建立的HCC原位肿瘤模型相比，其B超检测结果差异明显：用HepG2细胞系建立的HCC原位肿瘤模型为B超探查复杂回声的HCC病灶（图1），而利用手术切除标本建立的HCC原位肿瘤为典型的低回声病灶（图3A）。HCC临床影像探查已明确证实，HCC以B超探查低回声病灶最为常见，而混杂回升和高回升病灶较为少见，这也从一个方面证实了本研究方法的优势。②恶性程度较高的HCC标本获得的肿瘤病灶具有明确的侵袭特性，能够造成不同肝叶的黏连和侵袭。本研究利用HCC患者手术切除标本建立免疫缺陷小鼠肝脏原位肿瘤模型，这一模型不仅可用于预测HCC相关抗肿瘤药物的敏感性，也可能对判别HCC的恶性程度和预后预测提供参考。本研究不仅具有重要的科研价值，也有助于为HCC临床分子靶向治疗提供有价值的药物敏感性预测信息。

综上，我们获得了相关研究模型，在未来研究中将对方法进行优化：①HCC肿瘤自身特性较为疏松，临床HCC手术切除标本质地较软，这给原位肿瘤建模带来一定影响；②受限于各种原因，能够获得的肿瘤标本受限，难以获得很大量标本，同时标本中仅极少部分性状较好，因此难以接种更多实验动物；③与HCC临床诊疗不同（现已发展出系统的HCC患者对症支持治疗策略），研究过程中实验动物易因虚弱而死亡，因此开发和建立相关支持疗法或手段亦有重要意义。

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Establishment of a Novelin vivoSensitivity-Testing Model for HCC Molecular Targeted Therapy

SUN Hui-Wei1,CHAI Yan-Tao1,ZHAO Shuang1,WANG Zhi-Jie1,XIE Hui2,HONG Zhi-Xian3,FENG Fan1*,HOU Jun1*
a.Research Center for Clinical and Translational Medicine;b.Center of Interventional Radiology for Oncology;c.Department of Hepatobiliary Surgery;the 302nd Hospital of Chinese PLA,Beijing 100039,China

Objective:To establish a novelin vivosensitivity-testing model for hepatocellular carcinoma（HCC）molecular targeted therapy.Methods:The clinical specimens from HCC patients were seeded in the liver tissues of BALB/c nude mice.After 4～6 weeks,thein situcancer nests were confirmed by a B-mode ultrasonography test.Sorafenib were given via oral gavage administration（2 mg/kg per two days）,and physiological saline was used as the solvent control.After 18 days treatment,the results were shown by anatomic or pathological analysis.Re⁃sults:Sorafenib significantly inhibited thein situgrowth of HCC in nude mice.Conclusion:This work successful⁃ly establishes a novelin vivosensitivity-testing model for HCC molecular targeted therapy.

hepatocellular carcinoma;molecular targeted therapy;immunodeficient animal;in situtumor growth;drug-sensitivity test

R730.5

A

1009-0002（2017）05-0671-05

10.3969/j.issn.1009-

*Co-corresponding authors,FENG Fan,E-mail:fengfanbio@126.com;HOU Jun,E-mail:houj302@163.com

2017-03-08

解放军第三〇二医院院长创新基金（YNKT2014039）

孙慧伟（1988- ），学士，实验师，（E-mail）mugoutaiji@163.com

冯帆，（E-mail）fengfanbio@126.com；侯俊，（E-mail）houj302@163.com