响应面法优化白酒糟富里酸的提取工艺

芮文君，赵 萍*，邱 悦，杨 恒，刘金涛，王 欢，张 轶

（兰州理工大学 生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730050）

响应面法优化白酒糟富里酸的提取工艺

芮文君，赵 萍*，邱 悦，杨 恒，刘金涛，王 欢，张 轶

（兰州理工大学 生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730050）

根据腐殖质的成因和白酒糟形成过程之间的相关联系，以鲜、干白酒糟为原料提取白酒糟富里酸，分析干、鲜白酒糟中富里酸的含量变化；对比水浴提取和超声提取条件下的富里酸得率，确定提取方法；单因素和响应面优化法确定最佳提取工艺条件。结果表明，鲜白酒糟中富里酸含量高于干白酒糟；超声提取法优于水浴提取法；富里酸的最佳提取工艺为固液比1∶8.4（g∶mL），pH值11.2，超声时间32 min，超声功率360 W，超声温度45℃，富里酸得率达6.29%。

白酒糟；富里酸；响应面；超声辅助；提取工艺

白酒糟是酒醅发酵完成后再经蒸馏出酒而残留的混合固形物，因此白酒糟中有相当多未利用的蛋白质、淀粉、脂肪等成分，与酒醅中的营养成分相似，只是在数量上有差别，而且鲜白酒糟的含水量达60%左右，不仅量大而集中且营养物质丰富[1-2]。目前，我国酒厂的固体白酒糟多作为烧柴、饲料或者农肥等，而这些利用并没有做到物尽其用，加之鲜酒糟因为含水量较高所以在利用方面会提高干燥和运输等成本，从而导致大量白酒糟被随意丢弃或焚烧[3-4]。鲜白酒糟如果不及时加以处理，易发霉变质，不仅浪费了宝贵的资源，还会污染周围环境。另外由于酿酒发酵过程中产生了复杂的生化变化，所以白酒糟中也产生了大量的新成分，如核糖核酸、嘌呤、嘧啶和其他一些次级代谢等产物[1-6]，对白酒糟的高值化利用提供了条件。因此，研究白酒糟中的活性成分，提高对白酒糟的综合利用，不仅直接影响酿酒生产企业的发展，而且同时对我国的资源开发和环境保护也具有重要的意义。

腐殖酸中颜色最浅和分子质量最低的组分称为富里酸（fulvic acid，FA），是人类已知的最好天然电解质，因为其功能基团比较密集、溶解性好、渗透力强，所以在某些生物活性方面高于其他组分的腐植酸[7-11]。FA的形成是由微生物的分泌物和植物性化学物质相结合且在腐殖化（分解）过程中不断进行结构重组而产生的一种分子结构及其复杂的有机物[9，12-14]。白酒醅在长时间发酵过程中，有机质的代谢过程与腐殖质的形成过程非常相似，白酒蒸馏后的酒糟中保留着大量的未被分解的有机质和微生物代谢产物，若能够充分合理地利用酒糟，不仅可以变废为宝，创造经济效益和社会效益，还能节约资源保护环境。因此，研究白酒糟富里酸（distillers grains fulvic acid，DFA）可为白酒糟的深入研究和综合利用提供了一定的理论依据和实验基础。

本研究直接利用白酒的酿造副产物白酒丢糟制备提取DFA，目的在于用更经济、更方便的手段提取DFA，同时为DFA的进一步研究提供一定的科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

白酒糟：甘肃金徽酒业集团提供，水分含量为63.67%的鲜白酒糟按料液比1∶2.5（g∶mL）的比例打成匀浆密封冷冻待用；干白酒糟：鲜白酒糟风干后粉碎过40目筛密封，置于4℃待用。

盐酸、硫酸：天津博逸化工股份有限公司；氢氧化钠、焦磷酸钠、硫酸亚铁铵：天津市光复科技发展有限公司；重铬酸钾、邻菲罗啉指示剂：烟台市双双化工有限公司。以上试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

FA2004电子分析天平：上海良平仪器仪表有限公司；RE52CS旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；JJ-2组织匀浆机：常州万丰仪器制造有限公司；KQ-250DE数控超声波清洗器：上海精密仪器仪表有限公司；HH-4数显恒温水浴锅：国华电器有限公司；GZX-9240MBE数显鼓风干燥箱：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；TDL-5-4离心机：上海安亭科学仪器厂；PHB-5型便携式pH计：中国杭州雷磁分析仪器厂；LGJ-10型冷冻干燥机：北京松源华兴科技发展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 白酒糟中DFA含量及得率的测定

DFA的测定采用容量滴定法，参考GB18877—2009《有机-无机复混肥料》中有机质含量的测定方法及相关文献中FA的测定方法[15-19]，按下列公式计算样品中DFA含量：

式中：0.003为四分之一碳的摩尔质量的数值，g/mmol；V0为滴定空白所消耗的硫酸亚铁铵标准溶液的体积，mL；V为滴定式样所消耗的硫酸亚铁铵标准溶液的体积，mL；C（Fe2+）为硫酸亚铁铵标准滴定溶液的浓度，mol/L；k为DFA碳系数一般取0.5；m为试样的质量，g；a为试样溶液的总体积，mL；b为测定时所取试样的体积，mL。

DFA得率按下列公式计算：

式中：m为提取的DFA质量，g；M为称取的白酒糟质量，g。

根据上述方法分别测量干白酒糟和鲜白酒糟（含水量为63.67%）中DFA含量（以绝干计，DW），3次重复[15，21]。

1.3.2 DFA提取方法的优选

恒温水浴提取法：取定量的鲜白酒糟匀浆于250 mL磨口锥形瓶中，加50 mL蒸馏水摇匀，加入1 mL 0.5 mol/L的焦磷酸钠后再用1 mol/L的NaOH调节pH值至10。充分摇匀后放入温度为40℃水浴锅中提取20min，以3900r/min离心15 min，取上清液再抽滤，用1 mol/L HCl调节滤液pH至2。冷沉12 h后以3 900 r/min离心15 min，收集上清液即为DFA提取液，旋蒸浓缩后冷冻干燥并称质量[19-24]，计算得率。

超声波辅助提取法：步骤同上，将水浴提取条件变为温度40℃，超声功率240 W，提取20 min，然后与水浴提取比较得率[19-27]。

1.3.3 不同因素对DFA提取效果的影响

采用1.3.2优选出的提取方法，选取固液比、碱溶pH、超声功率、超声时间、超声温度为影响因素，以DFA得率为评价指标，确定各单因素变量后依序实验选择最佳单因素的最佳水平为后续试验[28-33]。

选1.3.2优选后的方法，考察不同因素对DFA提取效果的影响[19-20，22]。

根据上述实验先将固液比变量定为：1∶2.5、1∶5.0、1∶7.5、1∶10.0、1∶12.5、1∶15.0（g∶mL）进行提取；预实验pH 8～10组的DFA得率变化不明显，确定固液比后，将pH变量定为8.0、9.0、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5；确定pH后，步骤同上依次按序分别确定超声功率（240W、300W、360W、420W、480 W、540 W、600 W）、超声时间（10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min）和超声温度（20 ℃、30 ℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃）。

1.3.4 Box-Behnken试验设计

根据单因素试验的结果，选取对DFA提取影响较大的3个因素确定Box-Behnken设计的因素和水平，以DFA得率（Y）为响应值，通过响应面分析优化提取条件[28-33]，响应面试验因素与水平见表1。

表1 提取条件优化响应面试验因素与水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments for extraction conditions optimization

2 结果与分析

2.1 DFA提取方法的确定

根据1.3.2的试验结果，对比恒温水浴提取法和超声波辅助提取法的DFA得率优选提取方法。其得率分别为4.16%和5.21%，表明在相同时间和相同温度条件下，超声波辅助提取明显优于水浴加热提取。超声波提取是利用超声空穴破坏细胞壁从而增加溶剂穿透力，这样能提高提取效率和缩短提取时间，以达到高效、快速提取细胞内容物的一种普遍运用的辅助提取方法[25-27]。因此，本试验选择超声波辅助法提取DFA。

2.2 不同白酒糟中DFA含量变化

表2 不同白酒糟中富里酸含量Table 2 Fulvic acid contents in different distillers grains

不同白酒糟在不同时间条件下的DFA含量结果见表2。根据表2可知，随着时间的推移，干白酒糟中DFA含量变化不大，而鲜白酒糟中DFA含量表现出先增大后减小的趋势，并且鲜白酒糟中的DFA含量明显高于干白酒糟。因此本试验采用鲜白酒糟直接提取，并密封保存以减小DFA含量的损失，既避免干燥带来的成本问题又能提高DFA得率[19-23]。

2.3 影响DFA提取的单因素分析

2.3.1 固液比对DFA提取效果的影响

固液比对DFA得率的影响见图1。由图1可知，随着溶剂量的增加，DFA的得率也逐渐增加，当固液比为1∶7.5（g∶mL）时，DFA得率达到最高，固液比继续增加，DFA得率趋于平缓。因此，从提取效果和溶剂用量及降低浓缩负荷等方面综合考虑，固液比定为1∶7.5（g∶mL）较为适宜。

图1 固液比对富里酸得率的影响Fig.1 Effect of solid and liquid ratio on fulvic acid yield

2.3.2 pH值对DFA提取效果的影响

pH值对DFA得率的影响见图2。由图2可知，随着碱液pH值的增加，DFA的得率先增加后减小，pH值在8.0～9.5之间时，DFA得率逐渐增加且增加较快，在10到11之间增加趋势趋于平缓，当pH=11.0时，DFA提取率达到最高。当pH＞11.0时得率开始下降且下降趋势较快。这可能是由于碱溶物达到饱和之后，在酸沉时析出产生更多沉淀，从而影响了DFA的得率。因此，从提取效果和资源节约方面考虑，选用碱液pH=11.0为最佳值。

图2 pH值对富里酸得率的影响Fig.2 Effect of pH on fulvic acid yield

2.3.3 超声功率对DFA提取效果的影响

超声功率对DAF得率的影响见图3。由图3可知，随着超声功率的增加，DFA得率先增加后减小，不过整体变化幅度不大，在超声功率为360 W时得率达到最大，之后开始下降，可能是较高的超声功率促进了溶液中各成分的相互作用，发生聚合氧化等反应从而降低DFA得率。所以将360 W定为最佳超声功率。

图3 超声功率对富里酸得率的影响Fig.3 Effect of ultrasonic power on fulvic acid yield

2.3.4 超声时间对DFA提取效果的影响

超声时间对DFA得率的影响见图4。由图4可知，超声时间在10～30 min内随着超声时间的增加，DFA得率增加相对较显著，超声时间为30 min时，DFA得率最大，当超声时间在30～60 min内，当DFA得率开始下降，但下降趋势较缓慢。分析原因可能是随着时间的延长，碱溶物发生降解、氧化或相互之间缩合等反应的几率也相应增高，所以酸沉时会产生更多沉淀从而影响得率，而且过长的超声时间也可能使白酒糟中的其他物质溶出使DFA含更多杂质，从而影响得率。综合考虑提取效果和节能等因素，选取30 min为最佳超声时间。

图4 超声时间对富里酸得率的影响Fig.4 Effect of ultrasonic time on fulvic acid yield

2.3.5 超声温度对DFA提取效果的影响

超声温度对DFA得率的影响见图5。由图5可知，超声温度在25～45℃之间时，随着超声温度的升高DFA的得率也在增加，不过整体增加幅度相对较小，但当超声温度高于45℃低于55℃时，随着温度的升高得率开始缓慢下降，超声温度高于60℃时，DFA得率下降迅速。分析原因可能是较高的超声温度促进了溶液中各成分之间的相互作用以及分解缩合氧化等反应使得率下降，或是高温不利于DFA的稳定，从而影响了DFA得率。所以将45℃定为最佳超声温度。

图5 超声温度对富里酸得率的影响Fig.5 Effect of ultrasonic temperature on fulvic acid yield

2.4 影响DFA提取因素的响应面分析

2.4.1 不同因素对DFA提取效果的影响

在单因素试验的基础上，综合考虑各因素对DFA提取效果的影响，根据Box-Behnken试验设计原理，选择固液比、超声时间、碱溶pH进行3因素3水平的响应面分析法，确定DFA的最佳提取条件，响应面试验结果与分析见表3，方差分析结果见表4。

表3 提取条件优化响应面试验设计及结果Table 3 Design and results of response surface experiments for extraction conditions optimization

将所得试验数据采用Design-Expert V8.0.6软件进行多元回归拟合，得DFA得率对固液比（A）、pH（B）、超声时间（C）的二次多项回归方程为：

Y=6.36+0.55A+0.17B+0.11C+0.08AB-0.035AC-0.025BC-

0.62 A2-0.41B2-0.28C2

表4 回归模型方差分析Table 4 Variance analysis of the regression model

由表4可知，模型F值为70.33，P＜0.000 1，表明响应面回归模型达到了极显著水平（P＜0.01）。失拟项P=6.34＞0.05，表示失拟不显著，模型的确定系数R2=0.989 1，说明该模型能解释98.91%响应值的变化，因而该模型拟合程度比较好，可以用此模型对DFA提取进行分析和预测。由回归模型和方差分析可知，方程一次项A、B、方程二次项A2、B2、C2对DFA得率的影响达到极显著水平（P＜0.01）；方程一次项C对DFA得率的影响达到显著水平（P＜0.05），交互项AB、AC、BC对DFA得率的影响不显著（P＞0.05）。根据F值可知，各个因素对DFA得率影响的大小顺序为[28-30]：固液比（A）＞pH值（B）＞超声时间（C）。

2.4.2 响应面直观分析

响应面分析结果见图6，图上能比较直观和形象的看出最佳因素参数及各因素之间的交互作用[28，32]。3个响应面图均为开口向下的凹形曲面，相应的等高线图呈明显的椭圆形，说明两因素之间交互作用显著（P＜0.01）[29-33]；且响应面图开口向下，说明响应值（DFA得率）在其范围内存在最大值。

根据回归方程求得固液比、pH、超声时间分别取1∶8.38（g∶mL）、11.17、32.42 min时，可得理论上的最大DFA得率为6.51%。结合实际操作条件，修正固液比为1∶8.4（g∶mL）、pH值为11.2、超声时间为32 min，3次重复得DFA实际得率为6.29%。由此可见，实际与理论值的相对误差为0.03%，真实值与回归方程的预测值偏差表明响应面优化对DFA进行提取的研究是合理可行的。

图6 固液比、pH和超声时间交互作用对富里酸得率影响的响应面和等高线Fig.6 Response surface plots and contour line of effects of interaction between solid and liquid ratio,pH and ultrasonic time on fulvic acid yield

3 结论

FA具有结构复杂易变等特点，一直以来都是研究的热点和难点，目前研究中的FA大多来自风化煤、化学合成、生化发酵或湖、海等地的沉积泥物中[18，24]，FA根据其原料的不同自身特性也大不相同。本文根据腐殖质的形成特性与白酒糟自身特点之间的某些相关联系，选择从白酒糟中提取DFA并研究其特性。不同状态的白酒糟中DFA的含量差异较大，选择用新鲜的白酒糟直接打浆提取DFA，即节省干燥成本又降低了DFA的损失。利用超声波辅助响应面优化提取工艺，得最佳提取工艺为固液比1∶8.4（g∶mL），pH值11.2，超声时间32 min，超声功率360 W，超声温度45℃，DFA得率达到6.29%。为DFA的深入研究提供一定的技术支持和科学依据。

[1]李 建，叶 翔.酒糟综合利用多元化研究[J].中国酿造，2013，32（12）：121-124.

[2]XIROS C,CHRISTAKOPOULOS P.Biotechnological potential of brewers spent grain and its recent applications[J].Waste Biomass Valor,2012,3(2):213-232.

[3]易 弋，黎 娅，李伟华，等.利用白酒糟生产蛋白饲料的研究[J].饲料研究，2009，12：27-29.

[4]左上春，杨海泉，邹 伟.白酒酒糟资源化利用研究进展[J].食品工业，2016（1）：246-249.

[5]李政一，周 定，侯文华.酒糟资源化研究[J].环境科学学报，2000，20（9）：145-149.

[6]谭之磊，刘建辉，马 凯，等.白酒糟综合利用新技术[J].广东化工，2015，42（7）：72-73.

[7]李艳红，庄 锐，张 政，等.褐煤腐植酸的结构、组成及性质的研究进展[J].化工进展，2015，34（8）：3147-3157.

[8]牛育华，李仲谨，郝明德，等.腐殖酸的研究进展[J].安徽农业科学，2008，36（11）：4638-4639.

[9]曾宪成.谈谈腐植酸[J].腐植酸，2001（4）：6.

[10]周霞萍，黄 琛.黄腐酸分子结构比较研究的新思考[J].腐植酸，2005（4）：17-20.

[11]邹德乙.腐植酸的概念与腐植酸分类问题的探讨[J].腐植酸，2011（4）：44-48.

[12]周少丽.黄腐酸研究进展[J].广州化工，2015，43（8）：41-42，45.

[13]KLUCAKOVA M,PEKARˇM.Study of structure and properties of humic and fulvic acids.III.study of complexation of Cu2+ions with humic acid in sols[J].J Polym Mat,2003,20(2):145-153.

[14]BUFFLE J,GRETER F L,HAERDI W.Measurement of complexation properties of humic and fulvic acids in natural waters with lead and copper ion-selective electrodes[J].Anal Chem,1977,49(2):216-222.

[15]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.GB/T 18877—2009有机-无机复混肥料[S].北京：中国标准出版社，2013.

[16]丁为民，秦 梅，吴宝华.生化黄腐酸定量分析方法研究[J].化学工程，2003，3（6）：58-59.

[17]杨献红，乔桂芳，段健康.容量滴定法测定黄腐酸含量[J].河南化工，2006，23（8）：42-43.

[18]林翠兰，曾思坚，蔡蝉凤，等.肥料中腐植酸测定的研究[J].腐植酸，2004（1）：13-15.

[19]李小为，金俊艳.从泥碳中提取黄腐酸的探讨[J].浙江农业科学，2011（4）：921-923.

[20]焦元刚，朱 红，邹 静，等.风化煤中黄腐酸的提取研究[J].化工时刊，2007，21（1）：30-32.

[21]高丽娟，王世强，赵雪飞，等.宁夏石嘴山褐煤腐植酸的提取工艺[J].湖北农业科学，2012，51（22）：5168-5170.

[22]邹 静，王芳辉，朱 红，等.风化煤中腐植酸的提取研究[J].化工时刊，2006，20（6）：10-12.

[23]杨天友，刘金涛，李刚凤.超声波辅助提取德江天麻多糖工艺优化[J].中国酿造，2015，34（12）：117-121.

[24]苏 芳，顾明广，冯献起.超声波辅助法提取葡萄籽中原花青素工艺的研究[J].中国酿造，2015，34（12）：113-116.

[25]陈 涛，桂 青，郭俊陆，等.传统工艺山西老陈醋发酵及熏蒸过程中常规成分的变化分析[J].中国酿造，2017，36（1）：39-43.

[26]侯学敏，李林霞，张直峰，等.响应面法优化薄荷叶总黄酮提取工艺及抗氧化活性[J].食品科学，2013，34（6）：124-128.

[27]高辰哲，姜 帆，王艳菲，等.响应面法优化红树莓酒发酵工艺[J].中国酿造，2016，35（12）：108-112.

[28]王海燕，李 睿，曾 秀，等.响应面优化超声波提取桑叶槲皮素工艺[J].食品科学，2014，35（22）：56-62.

[29]庞庭才，钟秋平，胡上英，等.响应面分析法优化碱蓬黄酮提取工艺[J].中国酿造，2016，35（11）：140-144.

[30]贺 寅，王 强，钟 葵.响应面优化酶法提取龙眼多糖工艺[J].食品科学，2011，32（2）：79-83.

[31]彭晓霞，路莎莎.响应面优化法在中药研究中的应用和发展[J].中国实验方剂学杂志，2011（19）：293-299.

Optimization of extraction technology of fulvic acid in distillers grains by response surface method

RUI Wenjun,ZHAO Ping*,QIU Yue,YANG Heng,LIU Jintao,WANG Huan,ZHANG Yi
(School of Life Science and Engineering,Lanzhou University of Technology,Lanzhou 730050,China)

According to the correlation between the formation of humus and distillers grains,using distillers grains as raw materials,fulvic acid was extracted from distillers grains.Compared with the content of the fulvic acid in dried and fresh distillers grains,the fulvic acid yield by water bath extraction and ultrasonic extraction methods were compared,and then the extraction method was determined.The fulvic acid extraction conditions were determined by single factor experiments and response surface experiments.Results showed that the fulvic acid contents in the fresh distillers grains was higher than that of the dry distillers grains,and ultrasonic assisted wethod was better than water bath extraction;the optimum extraction conditions were solid-liquid ratio 1∶8.4(g∶ml),pH11.2,ultrasonic time 32 min,power 360 W,temperature 45 ℃,and the yield of fulvic acid was 6.29%.

distillers grains;fulvic acid;response surface method;ultrasonic assisted;extraction process

TS209

0254-5071（2017）09-0082-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.09.018

2017-03-31

甘肃省高等学校科研项目（2014A-030）

芮文君（1989-），女，硕士研究生，研究方向为农产品加工与副产物综合利用。

*通讯作者：赵 萍（1964-），女，教授，硕士，研究方向为食品科学、农产品加工与副产物综合利用方面。