外周血甲基化Septin-9检测对结直肠癌诊断价值的Meta分析

李 丹 苏光建 肖燕萍 余小龙 崔兆磊 陈 燕

(福建省肿瘤医院检验科/福建医科大学附属肿瘤医院检验科/福建省肿瘤生物治疗重点实验室，福州 350014)

外周血甲基化Septin-9检测对结直肠癌诊断价值的Meta分析

李 丹 苏光建 肖燕萍 余小龙 崔兆磊 陈 燕①

(福建省肿瘤医院检验科/福建医科大学附属肿瘤医院检验科/福建省肿瘤生物治疗重点实验室，福州 350014)

目的Meta系统性评价Septin-9在结直肠癌中的诊断价值。方法检索PubMed、生物医学外文全文服务系统、Ovid、中国学术期刊全文数据库、中国生物医学文献数据库、维普中文科技期刊数据库、万方数据库，日期截止至2017年1月。严格按照纳入和排除标准筛选文献，并依据QUADAS标准对文献进行质量评估。使用双变量Meta模型合并检验效能分析，通过Q检验、I2检验检测研究异质性，通过亚组分析、敏感性分析探讨异质性来源，通过Deek's漏斗图评估发表偏移。结果共纳入11篇文献；Septin-9诊断结直肠癌的合并敏感度为0.70(95%CI：0.67～0.72)，合并特异度为0.91(95%CI：0.90～0.92)，诊断比值比为28.76(95%CI：17.70～46.75)，SROC的曲线下面积(AUC)为0.922 1。异质性检验提示不存在阈值效应，但存在其他因素引起的异质性。通过敏感性分析发现纳入文献中有一个离群值。亚组分析结果显示，根据1/3判为阳性和2/3判为阳性分组：AUC为0.939 7比0.826 5。根据亚洲人种和欧美人种分组：AUC为0.936 8比0.921 0。Deek's漏斗图评估纳入文献不存在发表偏倚。结论外周血甲基化Septin-9诊断结直肠癌的整体准确性较高，可作为一项很好的指标用于结直肠癌诊断。

结直肠癌；DNA甲基化；Septin-9；诊断价值；Meta分析

在中国，结直肠癌(Colorectal cancer,CRC)患者的发病率一直呈逐年上升趋势，2015年发病率和死亡率均排在肿瘤性疾病的第五位[1]。研究证实，约80%的CRC是由腺瘤性息肉演变而来，癌变前有长达10年的良性肿瘤发展阶段[2]，该时间窗为结直肠癌的预防和早期诊断提供了有利时机。早期诊断并有效的治疗在延长患者生存期方面有巨大的潜能[3]。CRC作为一种异质性疾病，具有CpG岛甲基化表型(CpG island methylator phenotype,CIMP)[4]。目前研究表明，Septin-9基因的甲基化可用于CRC的血清学诊断[5,6]。但现有的研究报道，关于Septin-9的检测结果之间有较大差异，敏感性36.6%～95.6%，特异性84.8%～99.0%，诊断效能不一致。本研究拟通过系统的Meta分析，评价Septin-9诊断CRC的合并效能。

1 材料与方法

1.1文献检索策略 本项Meta分析研究遵循PRISMA(Preferred Reporting Items for Systematic Reviews and Meta-Analysis)规范进行[7]。两位检索人员独立用网络搜索确定符合条件的研究文献。外文检索数据库为：PubMed、生物医学外文全文服务系统、Ovid，检索词是：“colon cancers”、“Colorectal Cancer”和“Septin 9” 、“SEPT 9”分别用不同的两两配对使用；中文检索数据库包括：中国学术期刊全文数据库(CNKI)、中国生物医学文献数据库(CBM)、维普中文科技期刊数据库、万方数据库，检索词是：“大肠癌”、“结直肠癌”和“Septin 9”、“SEPT 9”分别用不同的两两配对使用。文献检索日期截止至2017年1月12日。

1.2文献的纳入和排除标准 纳入标准如下：①研究评估外周血Septin-9甲基化在人结直肠癌中的诊断价值；②诊断明确，且以肠镜病理为诊断“金标准”；③研究对疾病组和对照组的定义清晰；④研究数据完整可用于2×2诊断四格表的构建。

排除标准如下：①中文和英文以外语种写作的文献；②样本例数小于20例；③无完整数据构建2×2诊断四格表；④会议论文摘要、综述、讲座、病例报告、专家意见和评论等。

1.3数据提取 对选定的文献进行数据提取，包括第一作者、发表年限、标题、国家、样本及对照组例数、检测方法、金标准、诊断标准、敏感度、特异度等。计算各项研究的真阳性率(TP)、假阳性率(FP)、假阴性率(FN)和真阴性率 (TN)用于构建2×2表。所有分歧均经小组讨论解决。

1.4质量评价 依据QUADAS (Quality Assessment of Diagnosis Accuracy Studies)标准对文献质量进行评估[8]。QUADAS标准包括14个问题，每项可被评价为“是”、“否”或“不清楚”，分别对应“1”、“0”和“0”分。

1.5统计学分析 统计分析使用MetaDisc 1.4和Stata 12.0软件。采用双变量的荟萃分析模型用于统计合并敏感度、特异度、诊断比值比(DOR)、阳性似然比(PLR)和阴性似然比(NLR)，并绘制综合受试者工作特征曲线(SROC)曲线。用Spearman相关系数、Cochran-Q检验、I2检验评估研究异质性。此外，用影响分析和回归分析探寻异质性潜在来源。通过Deek′s漏斗图，评估潜在的发表偏倚，P<0.05表示差异有统计意义。

2 结果

2.1文献纳入过程 研究选择的过程：通过数据库共搜索到36篇英文文献和47篇中文文献。首先去除重复的15篇文献，接着去除46篇基础研究、综述、指南等文献，进一步去除标本类型不是外周血或数据未能构建2×2四格表的文献7篇，最后排除QUADAS质量评估不合格的文献4篇。最终有11篇文献纳入此次的Meta分析。

2.2纳入文献的质量评估 本次研究最终入选11篇文献(表1)。均采用外周血标本进行检测，肠镜病理为诊断“金标准”。 采用QUADAS质量评价14个条目对纳入文献进行质量评估，结果见图1。

表1 Septin-9对结直肠癌诊断价值纳入文献的主要特征

Note：1)One or more positive results in three times repeated trials were judged positive；2).Two or more positive results in three times repeated trials were judged positive.

2.3异质性分析 使用MetaDisc 1.4软件进行异质性分析。分别检验阈值效应和非阈值效应。采用Spearman 相关系数分析阈值效应。Spearman 相关系数=0.225 ，P=0.420，说明本研究不存在阈值效应。分析非阈值效应采用Cochran-Q检验：Q=60.57，P=0.000；I2检验：I2=76.0%，说明本研究存在异质性，可能主要由非阈值效应引起。

图1 采用QUADAS质量评价对纳入文献的质量进行评估Fig.1 Study quality assessment using QUADAS checklistNote:QUADAS:Quality Assessment of Diagnosis Accuracy Studies[8];1.Representative spectrum;2.Acceptable selection criteria;3.Acceptable reference standard;4.Short time period between tests;5.All participants received reference standard;6.Same reference criteria used;7.Reference criteria independent of Index test;8.Repeatability of the Index test;9.Repeatability of reference criteria;10.Blinding of researchers to reference;11.Blinding of researchers to index test;12.Availability of clinical data;13.Uninterpretable results reported;14.Withdrawals explained.

2.4诊断效能 由于存在异质性，选用随机效应模型进行合并效应量的Meta分析(图2)。合并敏感度为0.70(95%CI:0.67～0.72)，合并特异度为0.91(95%CI:0.90～0.92)，合并阳性似然比为7.28(95%CI:5.61～9.46)，合并阴性似然比为0.30(95%CI:0.23～0.39)，诊断比值比为28.76(95%CI:17.70～46.75)，SROC的曲线下面积(AUC)为0.922 1。

2.5敏感度分析和亚组分析 通过敏感性分析，纳入文献中发现一离群值 “Hye Seung Lee 2013”(图3)，可能是研究异质性的来源之一。对该文献研究后进行剔除，重新合并效应量后发现合并敏感度由0.70(95%CI：0.67～0.72)提高到0.73(95%CI：0.70～0.75)，诊断比值比由28.76(95%CI：17.70～46.75)提高到32.40(95%CI：20.01～52.46)。亚组分析显示，根据阳性判断标准不同，剔除两个未说明的文献，其余文献根据1/3判为阳性和2/3判为阳性分组：合并敏感度分别为0.71(95%CI：0.67～0.74)比0.69(95%CI：0.65～0.72)，合并特异度为0.91(95%CI：0.90～0.92)比0.92(95%CI：0.90～0.94)，AUC为0.939 7比0.826 5。根据人种分组，分为亚洲人种和欧美人种：合并敏感度分别为0.67(95%CI：0.62～0.71)比0.71(95%CI：0.68～0.75)，特异度为0.93(95%CI：0.90～0.95)比0.91(95%CI：0.90～0.92)，AUC为0.936 8比0.921 0。见表2。

图2 纳入文献合并效应量的森林图Fig.2 Forest plots of pooled diagnostic indexes for the included studiesNote:A.Pooled sensitivity;B.Pooled specificity;C.Pooled DOR;D.SROC curve.

表2 亚组合并效应量的异质性分析

Note：1).One or more positive results in three times repeated trials were judged positive；2).Two or more positive results in three times repeated trials were judged positive.

图3 异常值检验Fig.3 Outlier detection analysis

图4 Deek′s漏斗图评估纳入文献的潜在发表偏倚Fig.4 Funnel plot for assessment of potential publication bias of included studies

2.6发表偏倚 采用线性回归制作Deek′s漏斗图，评估纳入文献的潜在发表偏倚，P=0.490，说明不存在发表偏倚(图4)。

3 讨论

Septin 9首次被发现参与癌症是在白血病中作为与MLL基因的一个融合产物[20]。随后研究表明,Septin-9在CRC中发挥抑癌基因作用，其在健康人群和其他非恶性肿瘤疾病中低表达，而在CRC患者外周血和肿瘤组织中存在高表达状态[13]，因此只需抽取外周血即能完成检测，患者接受度高[21]。这与患者低配合度的“金标准”结肠镜检查和临床常规粪便隐血试验筛查形成鲜明的对比，美国每年约44 000例CRC患者因害怕做结肠镜或粪便采样困难导致漏诊而死亡[22]。

Septin-9甲基化水平在诊断CRC的检验效能方面也明显优于传统的检查项目。本研究通过系统性Meta分析评估Septin-9甲基化诊断CRC的综合检验效能。结果显示合并敏感度为0.70，特异度为0.91，对应的SROC的曲线下面积(AUC)为0.922 1，表明Septin-9诊断CRC的整体准确性较高，尤其是特异度方面的表现优异，是一个很好的阴性排除试验。Warren[12]和 Tóth[17]等的研究中，当2/3判为阳性时，诊断特异甚至可以高达99%和98.9%。而He等[18]的研究中，当1/3判为阳性时，诊断特异度也可以达到96.5%。诊断比值比(DOR)是真阳性率与假阳性率的比值，是衡量一个诊断试验有效性的指标。DOR值的范围为0～∞，>1即表明具备诊断价值，值越高表明该试验有更高的准确性。在本研究中，合并DOR值为28.76，提示Septin-9对CRC的诊断价值较高。此外，本研究的合并阳性似然比为7.28，表明CRC患者外周血Septin-9检测结果为阳性的概率是非CRC患者的7.28倍。而合并阴性似然比为0.30，则提示所有的阴性检测结果中，有30%可能是假阴性。

异质性检验也是Meta分析很重要的一部分。本研究Spearman相关系数分析显示不存在阈值效应引起的异质性。进一步Cochran-Q检验和I2检验分析显示Cochran-Q检验的P=0.000，I2>50%，说明本研究存在异质性，主要由非阈值效应引起。由于本研究整体存在一定异质性，使合并效应量的准确度受到一定影响，故进行敏感性分析检验是否存在异常值。结果显示，纳入文献中存在一离群值“Lee 2013”，可能是研究异质性的来源之一。对该研究进行剔除后，重新合并效应量后发现：合并特异度仍维持在0.91，而合并敏感度由0.70提高到0.73，诊断比值比由28.76提高到32.40。此外，本研究纳入的文献中，阳性判断标准不同，可能是异质性的来源之一，故根据三次重复试验，有一次及以上或两次及以上出现阳性结果判断为阳性分组。分层分析后，合并的敏感度下降，特异度升高，AUC由0.939 7降为0.826 5，提示以1/3判为阳性的诊断价值更高。Nieminen 等[23]研究发现韩国人群Septin-9基因甲基化表达水平比欧美人种低，同时Lee等[24]的研究也证实，基因甲基化表达水平与种族有一定的相关性。故本研究也根据人种进行分组，分为亚洲人种和欧美人种：亚洲人种的合并敏感度比欧美人种低，这可能与Septin-9基因甲基化表达水平低有关；但在亚洲人种中整体诊断效能更高，合并AUC高达0.936 8。

本研究尚存在诸多不足之处：(1)Meta分析自身局限性：①语种偏倚：本研究只检索了中文和英文语种书写的文献，故其他语种发表的相关研究被遗漏；②发表偏倚：只能纳入可检索到的已发表文献。(2)纳入研究的局限性：①疾病谱偏倚：纳入文献试验的对照组多为健康人群，易混淆疾病少有比较；②人种代表性偏移：可检索到的文献中，亚洲人种目前只有中国和韩国，其他国家人群尚未见报道。

[1] Chen WQ,Zheng RS,Baade PD,etal.Cancer Statistics in China,2015[J].CA Cancer J Clin,2016,66 (2):115-132.

[2] 万德森．结直肠癌流行趋势及其对策[J].癌症,2009,28(9):897-902.

[3] Brenner H,Bouvier AM,Foschi R,etal.Progress in colorectal cancer survival in Europe from the late 1980s to the early 21st century:the EUROCARE study[J].Int J Cancer,2012,131(7):1649-1658.

[4] Worthley DL,Leggett BA.Colorectal cancer:molecular features and clinical opportunities[J].Clin Biochem Rev,2010,31(2):31-38.

[5] Li BS,Gan AH,Chen XL,etal.Diagnostic performance of DNA hypermethylation markers in peripheral blood for the detection of colorectal cancer:a meta-analysis and systematic review[J].PLoS One,2016,11(5):e0155095.

[6] Gyparaki MT,Basdra EK,Papavassiliou AG.DNA methylation biomarkers as diagnostic and prognostic tools in colorectal cancer[J].J Mol Med (Berl),2013,91(11):1249-1256.

[7] Moher D,Liberati A,Tetzlaff J,etal.Preferred reporting items for systematic reviews and meta-analyses:the PRISMA statement[J].J Clin Epidemiol,2009,62(10):1006-1012.

[8] Whiting P,Rutjes AW,Reitsma JB,etal.The development of QUADAS:a tool for the quality assessment of studies of diagnostic accuracy included in systematic reviews[J].BMC Med Res Methodol,2003,3(Suppl 1):1-13.

[9] deVos T,Tetzner R,Model F,etal.Circulating methylated SEPT9 DNA in plasma is a biomarker for colorectal cancer[J].Clin Chem,2009,55(7):1337-1346.

[10] Tanzer M,Balluff B,Distler J,etal.Performance of epigenetic markers SEPT9 and ALX4 in plasma for detection of colorectal precancerous lesions[J].PLoS One,2010,5(2):e9061.

[11] Grützmann R,Molnar B,Pilarsky C,etal.Sensitive detection of colorectal cancer in peripheral blood by septin 9 DNA methylation assay[J].PLoS One,2008,3(11):e3759.

[12] Warren JD,Xiong W,Bunker AM,etal.Septin 9 methylated DNA is a sensitive and specific blood test for colorectal cancer[J].BMC Med,2011,9:133.

[13] Lofton-Day C,Model F,Devos T,etal.DNA methylation biomarkers for blood-based colorectal cancer screening[J].Clin Chem,2008,54(2):414-423.

[14] 李士杰,刘艳刚,王 警,等.外周血Septin9 基因甲基化检测在结直肠癌筛查中的应用[J].中国普通外科杂志,2015,24(12):1756-1760.

[15] Church TR,Wandell M,Lofton-Day C,etal.Prospective evaluation of methylated SEPT9 in plasma for detection of asymptomatic colorectal cancer[J].Gut,2014,63(2):317-325.

[16] Lee HS,Hwang SM,Kim TS,etal.Circulating methylated septin 9 nucleic acid in the plasma of patients with gastrointestinal cancer in the stomach and colon[J].Translational Oncol,2013,6(3) :290-296.

[17] Tóth K,Sipos F,Kalmár A,etal.Detection of methylated SEPT9 in plasma is a reliable screening method for both left-and right-sided colon cancers[J].PLoS One,2012,7(9):e46000.

[18] He Q,Chen HY,Bai EQ,etal.Development of a multiplex MethyLight assay for the detection of multigene methylation in human colorectal cancer[J].Cancer Genetics and Cytogenetics,2010,202(1) :1-10.

[19] 郁 迪,张小虎,鲁辛辛.血清SEPT9 基因甲基化检测在结直肠癌诊断中的应用[J].临床检验杂志,2015,33(9):687-689.

[20] Osaka M,Rowley JD,Zeleznik-Le NJ.MSF (MLL septin-like fusion),a fusion partner gene of MLL,in a therapy-related acute myeloid leukemia with a t(11;17)(q23;q25)[J].Proc Natl Acad Sci U S A,1999,96(11):6428-6433.

[21] Taber JM,Aspinwall LG,Heichman KA,etal.Preferences for blood-based colon cancer screening differ by race/ethnicity[J].Am.J Health Behav,2014,38 (3) :351-361.

[22] Willyard C.To foster screening,new colon CanCer tests emphasize convenience[J].Nat Med,2014,20 (4) :322-323.

[23] Nieminen TT,Shoman S,Eissa S,etal.Distinct genetic and epigenetic signatures of colorectal cancers according to ethnic origin[J].Cancer Epidemiol Biomarkers Prev,2012,21(1) :202-211.

[24] Lee HS,Hwang SM,Kim TS,etal.Circulating methylated septin 9 nucleic acid in the plasma of patients with gastrointestinal cancer in the stomach and colon[J].Transl Onco1,2013,6(3):290-296.

[收稿2017-03-24 修回2017-06-29]

(编辑 张晓舟)

DiagnosticvalueofcirculatingmethylatedSeptin-9asabiomarkerforcolorectalcanceraMeta-analysisstudy

LIDan,SUGuang-Jian,XIAOYan-Ping,YUXiao-Long,CUIZhao-Lei,CHENYan.
DepartmentofLaboratory，FujianCancerHospital，FujianMedicalUniversityCancerHospital,FujianProvincialKeyLaboratoryofTumorBiotherapy,Fuzhou350014,China

Objective:A meta-analysis was use to systematically assess the diagnostic value of Septin-9 in Colorectal cancer.MethodsLiterature fulfilling the criteria was searched in PubMed,Foreign Medical Journals Platform,Ovid,CNKI,CBM,WanFang and VIP Databases from inception to Jan.2017.Literatures were strictly screened according to the inclusion and exclusion criteria.Study quality was assessed in terms of the Quality Assessment of Diagnostic Accuracy Studies (QUADAS) checklist.A bivariate Meta-analysis model was employed to assess the pooled accuracy,and study heterogeneity was evaluated via Cochran-Q and I2tests;subgroup analysis and sensitivity analysis were conducted to deeply trace the sources of heterogeneity;publication bias was judged by Deek′s funnel plot.ResultsA total of 11 studies were included.Analysis of methylated Septin-9 achieved a pooled sensitivity of 0.70 (95%CI:0.67-0.72),specificity of 0.91 (95%CI:0.90-0.92),and DOR of 28.76(95%CI:17.70-46.75),corresponding to an AUC of 0.922 1.Heterogeneity test suggested that there was obvious heterogeneity from non-threshold effect.Sensitivity analysis identified one outlier study.Subgroup analysis results showed that the AUC of 1/3 positive to 2/3 positive group was 0.939 7 versus 0.826 5,and the AUC of the Asian population group to the Caucasian population group was 0.936 8 versus 0.921 0.Funnel plot (Deek′s) revealed no publication bias.ConclusionOur data indicate that circulating methylated Septin-9 seemed to harbor a relatively high accuracy in conforming colorectal cancer,and might be popularized as a routine biomarker for colorectal cancer detection.

Colorectal cancer;DNA methylation;Septin-9;Diagnostic value;Meta-analysis

R735.3

A

1000-484X(2017)10-1547-05

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.10.022

李 丹(1984年-) ，女，硕士，检验技师，主要从事肿瘤实验诊断和临床生化研究。

及指导教师：陈 燕(1963年-) ，女，主任医师，教授，主要从事肿瘤实验诊断的基础和临床研究，E-mail:yanc99@sina.com。