IL-37抑制IL-18在大鼠肺纤维化模型中的表达及意义的探讨①

孙云晖 王一新 马雪梅 章 婷 赵艳景

(佳木斯大学附属第一医院，佳木斯 154003)

IL-37抑制IL-18在大鼠肺纤维化模型中的表达及意义的探讨①

孙云晖 王一新 马雪梅 章 婷 赵艳景

(佳木斯大学附属第一医院，佳木斯 154003)

目的初步研究博来霉素致肺纤维化大鼠肺组织中IL-37、IL-18的表达水平，探讨其在PF发生、发展中的表达及意义。方法将45只清洁级Wistar大鼠按随机数字表法分为健康对照组(N组)、博来霉素组(B组)、地塞米松治疗组(D组)，每组大鼠各15只，B组及D组大鼠给予气管内注射博来霉素4 mg/kg制作肺纤维化模型，N组给予相同体积生理盐水作为对照，D组大鼠于肺纤维化造模基础上第2天每日腹腔注射地塞米3 mg/kg，N、B组大鼠腹腔注射生理盐水作为对照。各组大鼠分别于造模后第7、14、28天处死，HE染色评价肺组织病理形态学变化，碱水解法及酶联免疫吸附法分别测定肺组织匀浆中羟脯氨酸(HYP)、IL-37含量，RT-PCR法测定肺组织中IL-18mRNA表达量。结果①HE染色显示B、D组大鼠肺组织病理学改变由肺泡炎症逐渐发展为纤维化，B、D组HYP含量随时间推移逐渐升高，以第28天为著(P<0.05)；②B、D组IL-37、IL-18mRNA表达于第7天升高至最高点，后逐渐降低，至第28天均高于N组，差异有统计学意义(P<0.05)；③D组IL-37、IL-18mRNA表达在同一时间均低于B组(P<0.05)。结论IL-37、IL-18在大鼠肺纤维化发病早期起重要作用，可能参与了肺纤维化发生与发展。

肺纤维化；IL-37；IL-18；博来霉素

肺纤维化(Pulmonary fibrosis，PF)是一种原因不明的慢性间质性肺部疾病，其病理主要表现为弥漫性肺泡炎、肺泡结构紊乱、细胞外基质(Extracell-ular matrix，ECM)大量沉积等[1]。有研究报道肺纤维化是由肺组织受到损伤后，修复调节失控及重建异常引起的病理改变，是一系列细胞因子、炎性因子、生长因子等通过多条信号转导通路共同作用的结果[2]。IL-37是IL-1家族新发现的细胞因子，有研究报道IL-37可通过负反馈调节机制调节先天性及固有免疫应答，抑制促炎细胞因子、趋化因子等的产生和对基因转录调节[3]。IL-18通过调控多种细胞信号转导通路，促进炎症发生、细胞分化、细胞因子生成等作用[4]。本实验建立博来霉素致大鼠肺纤维化模型，探讨IL-37/IL-18轴在其发病中的作用及意义，可为阐明这类疾病发病机制及治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 健康清洁级Wistar大鼠45只(雌雄各半)，6周龄，体重180～220 g，由哈尔滨医科大学实验动物学部提供[许可证号：SCXK(黑)2013-001]，随机分为健康对照组(N组)、博来霉素组(B组)和地塞米松治疗组(D组)，每组各15只大鼠，于佳木斯大学动物中心饲养。

1.1.2实验材料与试剂 注射用盐酸博来霉素BLM(海正辉瑞制药有限公司提供)；HE染色试剂(湖北锦源医疗科技有限公司提供)；Nikon eclipse 50i显微镜(北京中仪光科科技发展有限公司提供)；IL-37大鼠ELISA试剂盒(上海恒远生物科技有限公司提供)；大鼠HYP试剂盒(上海劲马实验设备有限公司提供)；RNA提取试剂盒(北京艾德莱生物科技有限公司)；cDNA反转录试剂盒及PCR试剂盒(大连宝生物工程有限公司)。

1.2方法

1.2.1模型建立及标本留取 B、D组以4 mg/kg剂量博来霉素一次性快速推注至气管内，N组给予等体积生理盐水。D组大鼠于肺纤维化造模基础上第2日开始每日腹腔注射地塞米松3 mg/kg；N、B组大鼠腹腔注射生理盐水作为对照。各组大鼠造模后分别于第7、14、28天处死，取右上肺组织置于10%甲醛溶液中固定、脱水、石蜡包埋、常规切片，HE染色，观察肺组织结构的病理形态学变化；从左肺组织上留取50 mg肺组织，制备组织匀浆，用于HYP、IL-37检测；取右肺组织100 mg，放入Eppendorf 管内，-80℃保存，用于检测IL-18mRNA表达水平。

1.2.2ELISA方法 碱水解法测定肺组织HYP含量，ELISA法检测肺组织IL-37表达水平，均严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.2.3RT-PCR检测肺组织IL-18mRNA表达水平 提取肺组织总RNA，反转录为cDNA。目的基因IL-18mRNA上游引物：5′-GAGGACTGGCTGTG-ACCCTATC-3′，下游引物5′-CCTGGCACACGT-TTCTGAAA-3′，扩增片段151 bp。内参照 β-actin mRNA 上游引物：5′-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3′，下游引物5′-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3′，扩增片段150 bp。PCR反应条件严格按照试剂盒说明书进行。

2 结果

2.1大鼠肺组织病理形态学HE染色结果 N组大鼠肺组织气道上皮光滑，无炎性细胞渗出，无纤维化形成。B、D组大鼠第7天肺组织沿支气管、肺组织炎性细胞渗出浸润，累及肺泡气管周围；第14天肺组织、气管、动脉周围炎细胞渗出较前略减少，部分肺泡结构消失，成纤维细胞增生；第28天肺组织大量结构破坏，肺泡间隔明显增宽，肺组织呈明显纤维化改变，B组与D组比较，纤维化程度加重。见图1。

2.2大鼠肺组织HYP含量变化 与N组比较，B、D组大鼠肺组织匀浆中HYP含量于造模后第7天明显升高，第28天达高峰，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

2.3ELISA法检测肺组织IL-37水平 B、D组IL-37含量于第7天达高峰，后逐渐降低，第28天仍高于N组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

2.4大鼠肺组织中IL-18mRNA表达水平 随着时间进展B、D组肺组织IL-18mRNA表达量第7天达高峰，后逐渐下降，第28天仍高于N组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表3、图2。

图1 肺组织HE染色病理学改变Fig.1 Pathological changes of lung tissue with HE staining

表1 实验大鼠肺组织羟脯氨酸含量(μg/mg)

Note：Compared with group N,1)P<0.05.

表2 IL-37在各组大鼠肺组织中含量比较(pg/ml)

Note：Compared with group N,1)P<0.05.

表3 IL-18mRNA在各组大鼠肺组织中表达水平

Note：Compared with group N,1)P<0.05.

图2 IL-18mRNA扩增图Fig.2 IL-18mRNA amplification map

3 讨论

本实验建立大鼠肺纤维化模型，采用当前国内外公认并广泛应用的气管内注入博来霉素的实验方法[5]，因HYP含量可以反映机体胶原代谢情况，故测定组织中HYP含量，可以反映肺纤维化严重程度[6]。此次实验一次性快速气管内推注博来霉素4 mg/kg 后，大鼠肺组织病理由初期的肺泡炎阶段发展为后期的肺纤维化性变。B组、D组HYP含量随时间进展逐渐升高，第28天达高峰，这与Huang等[7]报道一致,提示肺纤维化动物模型制作成功。

目前，细胞因子参与肺纤维化过程中的机制研究逐渐成为热点，有学者认为造成肺纤维化的基础是细胞因子的调控失衡作用。但近年来，大量动物实验证明起关键作用的可能不是Th1/Th2型细胞因子[8，9]。

为探讨IL-37及IL-18在肺纤维化中的表达及意义，实验采用ELISA法测定肺组织匀浆中IL-37含量，RT-PCR法检测IL-18在大鼠肺纤维化模型中的动态表达。结果发现，B组、D组中IL-37、IL-18表达在不同时间点均高于N组(P<0.05)，尤其在第7天肺泡炎阶段，IL-37含量及IL-18mRNA表达达高峰。B组中IL-18mRNA表达于第7天至高峰，后逐渐下降，第28天仍高于N组，这与文献[10]报道相一致。提示IL-37、IL-18可能与肺纤维化形成过程中的炎症损伤及纤维化形成密切相关。其可能的机制为：IL-37作为抑炎因子，阻断Toll样受体信号转导、抑制磷酸化STAT1-4的活性、下调树突状细胞(DC)，抑制早期促炎因子IL-1β、IL-6、IFN-γ、TNF-ɑ等表达[11]。有研究发现IL-37能与IL-18BP结合形成复合物而抑制IL-18的信号转导通路，抑制促炎因子表达，下调炎症应答反应[12]。Nold等[13]用抑制物SIS3阻断Smad3后发现，IL-37对炎症因子表达的抑制效应被阻断，提示IL-37可通过抑制Smad3表达而抑制肺纤维化的发展。IL-18可促进IL-9、IL-13、TNF-ɑ及GM-CSF等的表达[14]；诱导细胞间黏附因子ICAM-1的表达而促进炎细胞募集，上调NF-κB的表达和活性，它参与肺纤维化模型早期肺损伤阶段，并与调控多种细胞因子的表达有关[15]。另外，IL-18作用于NK细胞时，上调FasL的表达，增强对阳性靶细胞的毒性，Fas-FasL介导的支气管和肺泡上皮细胞的凋亡也参与博来霉素诱导的肺纤维化[16，17]。故我们认为IL-18可能是肺纤维化中重要的炎症因子，通过调节细胞因子表达参与和维持炎症发生、发展，并因此参与早期肺损伤。本实验中，B、D组IL-37、IL-18的表达均于第7天达高峰，后逐渐下降，提示两者参与肺纤维化早期肺泡炎症反应阶段，IL-18高水平表达反馈性促进IL-37表达上调，从而下调炎症反应，保护机体免受炎症损害。体外研究证实，IL-18等炎症因子可以诱导IL-37合成，二者在相关疾病的免疫调节中，发挥着相辅相成的炎症激发和抑制作用[18]。推测，IL-37和IL-18在大鼠肺纤维化早期肺泡炎症阶段发挥重要作用，可能参与了肺纤维化发生与发展。

本实验发现，应用地塞米松治疗的D组IL-37、IL-18表达水平及变化趋势与B组相一致，表达水平同时间低于B组(P<0.05)，差异有统计学意义。可能的作用机制为：地塞米松是一种强效的免疫抑制剂，一定程度上抑制多种细胞因子的合成和分泌，抑制免疫效应细胞功能及降低免疫复合物表达水平，减轻IPF的肺泡炎和纤维化[19]。本研究提示，地塞米松可通过抑制IL-18的表达，从而减少细胞因子表达，减轻炎症反应，抑制肺纤维化进展。

本实验在动物水平探讨了关于IL-37、IL-18在肺纤维化中的作用和机制。实验动物和人类发病机制基本相同，但仍存在差异，应进一步进行临床实验研究，为纤维化的治疗提供依据。

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[收稿2017-05-04 修回2017-05-25]

(编辑 倪 鹏)

ExpressionandsignificancediscussionofIL-37inhibitsIL-18inratpulmonaryfibrosismodels

SUNYun-Hui,WANGYi-Xin,MAXue-Mei,ZHANGTing,ZHAOYan-Jing.
TheFirstAffiliatedHospitalofJiamusiUniversity，Jiamusi154003，China

Objective:To investigate the expression of IL-37 and IL-18 in the lung tissue of rats with bleomycin induced pulmonary fibrosis,and to explore the expression and significance of PF in the lung.Methods45 Sprague Wistar rats were randomly divided into normal control group(N Group),bleomycin group(B group),dexamethasone group(D group),15 rats in each group.B group and D group rats were given intratracheal injection of bleomycin 4 mg/kg，pulmonary fibrosis model was made,N group was given the same volume of normal saline as control group D,rats in pulmonary fibrosis model based on second days of daily intraperitoneal injection of dexamethasone 3 mg/kg；N,B group rats were intraperitoneally injected with normal saline as control.The rats were sacrificed after modeling 7,14,28 days,HE staining was used to evaluate the lung tissue pathological changes；hydroxyproline in lung tissue was measured by alkali hydrolysis and enzyme linked immunosorbent assay(HYP),the content of IL-37,the determination of expression of IL-18mRNA in lung tissue by RT-PCR.Results①HE staining showed that B,D group of rat lung tissue pathological changes by alveolar inflammation gradually developed into liver fibrosis；B,D group HYP content increased gradually with the elapse of time,for 28 days(P<0.05).②B,D group IL-37,the expression of IL-18mRNA on the seventh day increased to the highest point.After gradually reduced，to 28 days were higher than N group,the difference was statistically significant(P<0.05).③The expression of IL-37 and IL-18mRNA in group D was lower than that in group B at the same time(P<0.05).ConclusionIL-37,IL-18 play an important role in the early stage of pulmonary fibrosis in rats,and may be involved in the occurrence and development of pulmonary fibrosis.

Pulmonary fibrosis； IL-37； IL-18；Bleomycin

①本文为佳木斯大学校级面上项目(JMSUJCMS2016-049)和佳木斯大学研究生科技创新项目医药类重点项目(YZ2016-019)。

R392.12

A

1000-484X(2017)10-1464-04

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.10.005

孙云晖(1970年-)，女，硕士，主任医师，硕士生导师，主要从事肺间质纤维化及慢阻肺方面的研究，E-mail：394849603@qq.com。