骨髓间充质干细胞移植对动脉粥样硬化大鼠外周血CD4+CD25+Treg细胞数量的影响

张园　张泉　孟春

[摘要] 目的 探讨骨髓间充质干细胞移植前后对动脉粥样硬化大鼠外周血CD4+CD25+Treg细胞数量的影响，以及对相关炎症因子及动脉粥样硬化（AS）的影响。 方法 90只雄性Wistar大鼠分正常饮食组（30只）和高脂饮食组（60只），并将高脂饮食组大鼠分对照组（30只）和移植组（30只），移植组经尾静脉注射MSCs悬液（细胞1×106溶于200 μL PBS中），对照组给予200 μL PBS，采用全自动生化仪分析总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C），ELISA法测定外周血血清中水平，应用流式细胞仪检测CD4+CD25+Foxp3 Treg细胞水平，采用苏木精-伊红染色观察组织学变化。 结果 组织学分析表明成功建立了动脉粥样硬化模型。对照组大鼠血脂、炎症因子较正常饮食组的水平升高（P < 0.05），移植组第4周血脂、血浆炎症因子水平降低（P < 0.05），CD4+CD25+Treg细胞、CD4+CD25+Foxp3数目增多（P < 0.05）。 结论 对AS大鼠进行BMMSCs移植可以上调CD4+CD25+Treg细胞，促进Foxp3表达，并可以降低血脂和炎症因子，为抑制AS的发生发展及稳定斑块提供一种新思路。

[关键词] 动脉粥样硬化；骨髓间充质干细胞；炎症因子；CD4+CD25+Treg细胞

[中图分类号] R543.5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）09（c）-0029-05

[Abstract] Objective To explore the effect on the number of CD4+CD25+regulatory T cells in the peripheral blood of the rats with AS after the mesenchymal stem cells transplanted into them and the effects of the two cells on the related inflammatory factors and AS. Methods 90 male Wistar rats were divideinto two groups： the normal diet group （30 rats） and the high-fat diet group （60 rats）， and the high-fat diet group were divide into the control group （30 rats） and the transplanted group （30 rats）. MSCS suspension （1×106 cells dissolved in 200 μL PBS） were injected into the transplanted group via the tail vein， while the control group were given 200 μL PBS. TC， TG， HDL-C， and LDL-C were analyze by automatic biochemical analyzer， the levels of hs-CRP and IL-6 in peripheral blood serum were measurated by ELISA and the level of CD4+CD25+Foxp3 Treg cells were observed by flow cytometry and the histological changes were observed by hematoxyli eosin stain. Results The histological analysis showed that the model of atherosclerosis was formed sucessfully. The blood lipid and inflammatory factors of control group were than the normal diet group（P < 0.05）. The levels of blood lipid and inflammatory factors the transplanted group decreased after 4 weeks （P < 0.05）， and the number of CD4+CD25+ regulatory T cells and CD4+CD25+Foxp3 increased（P < 0.05）. Conclusion The transplantation of BMMSCs to Wistar rats with AS can increase the number of CD4+CD25+regulatory T cells， promote the expression of Foxp3， and decline blood lipid and inflammatory factors， thus providing a new idea to restrain the occurrence and development of AS and stabilize the plaques.

[Key words] Atherosclerosis； Bone marrow mesenchymal stem cells； Inflammatory factors； CD4+CD25+Treg cells

動脉粥样硬化（AS）是心脑血管病的发病基础，心脑血管病是成人死亡和发病的最主要原因[1]。骨髓间充质干细胞（BMMSC）可以上调CD4+CD25+Treg细胞[2]，促进其细胞因子的分泌，抑制免疫和炎性反应，成为许多疾病治疗的种子细胞。CD4+CD25+Treg细胞是近年来新发现具有免疫负性作用的T细胞，在许多免疫反应疾病中起免疫无反应和免疫抑制的功能。AS是一种慢性炎性反应过程，整个过程都有免疫反应参与。BMMSC与CD4+CD25+Treg细胞都与AS有关，那么BMMSCs是否通过提高CD4+CD25+Treg细胞水平而达到抑制AS的作用，本文就二者对AS发生发展的影响展开讨论。endprint

1 材料与方法

1.1 实验材料

SPF级Wistar大鼠购自山东鲁抗医药公司实验动物中心，合格证号：ScXK（鲁）2008002；FACS Calibur型流式细胞仪、TGL-16B高速台式离心机、Leiea DM400oB光学显微镜和Leiea Qwinv 3图像分析软件、Olympus AU2700全自动生化分析仪、标准饲料等由潍坊医学院中心实验室提供；维生素D3注射液购自上海通用药业股份有限公司，ELISA试剂盒购自欣博盛生物科技有限公司，胰蛋白酶消化液购自美国Gibco公司。

1.2 方法

1.2.1 实验分组及AS模型制备 90只8周龄、体重约250 g的大鼠随机分正常饮食组（n = 30）和高脂饮食组（n = 60），高脂组随机分对照组（n = 30）和移植组（n = 30）；高脂组给予高脂饮食（3%胆固醇、0.7%胆酸钠、13%猪油、7%白糖、0.3%丙基硫氧嘧啶、76%标准饲料），并给予维生素D3 60 0000 U/kg腹腔注射，喂养开始时1次，后每4周1次，共4次；正常饮食组标准饲料喂养，并同等剂量生理盐水腹腔注射。

1.2.2 BMMSCs的获取 BMMSCs形态学上一般表现为细胞体积较大，呈长梭形或纺锤形，可以聚集形成集落。本实验通过全骨髓培养法获得BMMSCs[3]。4周龄体重约120 g大鼠4只，颈椎脱臼处死，无菌条件下分离股骨及胫骨，反复冲洗骨髓腔。将冲出的骨髓收集至无菌离心管中，选用全骨髓贴壁法分离BMMSCs，进行原代培养，细胞融合80%～90%时按1∶2进行传代培养，传到4～5代后-150°C冷冻保存，使用时将其放于37℃水浴中快速振摇解冻复苏。

1.2.3 BMMSCs的移植 移植组大鼠自尾静脉注入MSCs悬液（细胞1×106溶于200 μL PBS中），对照组经尾静脉注入200 μL PBS，高脂组继续高脂饮食。

1.2.4 病理切片制备 随机选取12周后的正常饮食组和对照组、MSCs移植组大鼠各2只，处死解剖游离其主动脉瓣上起始段至髂总动脉分叉处的胸腹主动脉全长，放入10%甲醛内浸泡固定，将固定好的病理组织用清水冲洗，乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋后切片机以5 μm连续切片，进行HE染色[4]。

1.2.5 血脂及炎症因子测定 随机选取12周后的正常饮食组和对照组大鼠、MSCs移植组第1、2、4周大鼠各8只，自大鼠尾静脉各抽取6 mL血液用于实验。各取2 mL血液用Olympus AU2700全自动生化分析仪检测血脂[包括总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）]；另各取2 mL用ELISA双抗夹心法检测超敏C-反应蛋白（hs-CRP）和白介素-6（IL-6）浓度。

1.2.6 CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞测定 将“1.2.5”中留取的静脉血2 mL，储存于肝素抗凝管中。加全血50 μL至检测管和对照管中，分别加入Anti-Rat CD4 FITC 1μL、Anti-RatCD25 Percp-eFluor710 0.5μL 和Mouse IgG2aK Isotype Control FITC 1 μL、Mouse IgG1k Isotype Control Percp-eFluor710 0.5 μL。1500 r/min离心5 min，重复2次；分别加Anti-Mouse/Rat Foxp 3-PE和Rat IgG2ak Isotype control PE 5μL混匀，4℃冰箱放置30 min；加1 mL1×破膜液1500 r/min离心5 min弃上清；上流式细胞仪检测获取数据。

1.3 统计学方法

采用统计软件SPSS 17.0对数据进行分析，正态分布的计量资料以均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组病理情况

高脂饮食组与正常饮食组比较出现AS改变，内皮细胞排列紊乱，可见大量泡沫样细胞并形成脂核，平滑肌细胞排列紊乱、断裂，BMMSCs移植后1、2、4周，动脉内膜逐渐平滑、规整、连接，内膜下泡沫细胞逐渐减少，脂质核变小，斑块稳定。见图1。

2.2 各组大鼠血脂水平

对照组与正常组比较，对照组TG、TC、LDL-C水平升高，差异有统计学意义（P < 0.05）；移植后第1、2周与对照组比较，血脂有降低趋势，但差异无统计学意义（P > 0.05）；移植第4周与对照组比较，移植组血脂明显降低，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表1。

2.3 各组炎症因子水平

对照组与正常组比较，对照组CRP、IL-6水平升高，差异有统计学意义（P < 0.05）；移植后第1、2周与对照组比较，两者有降低趋势，但差异无统计学意义（P > 0.05）；移植第4周与对照组比较，移植组两者水平明显降低，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表2。

2.4 各组CD4+CD25+Treg细胞及Fox3表达

对照组与正常组比较，对照组CD4+CD25+Treg细胞及Foxp3水平降低（P < 0.05）；移植第1、2周组与对照组比较，两者有升高趋势，但差异无统计意义（P > 0.05）；移植第4周组与对照组比较，两者水平明显升高，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表3、图2～3。

2.5 骨髓间充质干细胞形态

接种后细胞在培养瓶中散在分布，呈圆形。原代培养：24 h后开始贴壁，72 h后贴壁细胞表現为多角形、不规则或圆形，单个生长，5～7 d逐渐形成集落，形态呈长线形、不规则或多角形，仍能见圆形细胞夹杂，10 d后细胞集落快速增殖，细胞开始聚集生长，逐渐形成“漩涡状”，部分大的集落开始融合，14 d时大的集落相互重叠融合。传代培养：传代6 h后细胞慢慢贴壁呈长梭形伸展，均匀生长并逐渐形成大的集落，大约4～5 d圆形、未贴壁细胞显著减少，传至第3、4代的BMMSC形态基本呈长梭形，没有圆形的杂细胞。见图4。endprint

3 讨论

AS是高血压、冠心病、心肌梗死等多种心血管疾病的病理基础，其中氧化应激损伤和炎性反应是重要的病理机制[5-8]。导致AS发病的因素非常多，比如高血脂、内皮损伤、炎症、慢性应激[9]；AS被认为是一种慢性炎症，炎性反应可以通过多种途径促进AS的发生和发展[10]。CRP和IL-6在炎症斑块中起重要作用，不仅参与AS的行成，也是斑块不稳定的触发因素[11]。

免疫系统是参与AS炎性反应的重要组成部分，在炎性反应初始阶段起核心作用。调节性T细胞是具有免疫抑制功能的T细胞亚群，CD4+CD25+Treg是调节性T细胞的亚群之一，是成熟全面功能的T细胞亚群[12-13]，具有免疫抑制与免疫无能性作用[14]，在慢性炎性反应中起重要作用。CD4+CD25+Treg主要通过免疫负性调节来减少自身免疫性疾病的发生，在机体维持自身免疫应答稳态方面起到重要作用[15]。Foxp3是Treg细胞的特征性核转录因子，在维持Treg细胞特征性基因表达、分化和发育以及Treg细胞的抑制性功能方面不可或缺[16-17]。BMMSCs具有再生能力和一定的免疫调节作用[18-19]，本实验中BMMSCs通过上调CD4+CD25+Treg细胞抑制免疫反应和炎性反应，使血CRP、IL-6水平降低，从而抑制AS的炎性反应，抑制AS形成，这一点体现在本实验中所做的病理切片上。BMMSCs移植后，上调CD4+CD25+Treg细胞，并促进转录因子Foxp3的表达。CD4+CD25+Treg细胞发挥其抑制免疫反应的作用，内皮细胞发挥抗炎、抗脂质氧化等作用，二者共同抑制冠状动脉粥样硬化形成，延缓AS进展。

本实验显示，对照组较正常组大鼠血脂、hs-CRP、IL-6水平明显升高，CD4+CD25+Treg细胞及其转录因子Foxp3水平明显下降，反映了CD4+CD25+Treg细胞在AS过程中的免疫反应过程。动脉内皮损伤后，分泌许多活性因子，募集更多的炎症细胞到达局部后分泌更多的活性物质和炎症因子，其可抑制CD4+CD25+Treg细胞及其转录因子Foxp3的表达。在BMMSCs移植后2周，血脂，炎症因子开始下降，CD4+CD25+Treg细胞及其转录因子Foxp3的表达开始上调，第4周后出现显著改变，反映BMMSCs移植對CD4+CD25+Treg细胞及其产生转录因子Foxp3的表达产生了有益的影响。其可能不仅有利于维护动脉内皮细胞结构完整性，更有利于其功能的恢复，从而有利于调节免疫、抑制炎症反应，在抑制AS发生、发展过程中发挥重要作用。

目前对CD4+CD25+Treg细胞在冠心病治疗中的研究尚不成熟，本研究虽能够观察到BMMSCs移植对大鼠动脉粥样硬化模型有益的影响，但毕竟其与人类动脉硬化还有很大差异，此方法应用于人类还有待考究。

综上所述，AS过程中CD4+CD25+Treg细胞及Foxp3+的表达受到抑制，使炎症因子CRP和IL-6升高；BMMSC移植后可以上调CD4+CD25+Treg细胞及Foxp3+的表达，抑制炎性反应，使hs-CRP和IL-6降低，起到抑制动脉粥样硬化发生、发展及稳定斑块的作用。

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（收稿日期：2017-06-12 本文编辑：苏 畅）endprint