乌梅喷雾剂对大鼠颌下腺放射性损伤的影响

陈倩怡　李碧霞　叶景云

[摘要] 目的 探討乌梅喷雾剂对大鼠颌下腺放射性损伤的影响。 方法 健康SPF级雄性6～7周Wistar大鼠30只采用随机数字表法分为正常组，模型组和高、中、低乌梅喷雾剂组，每组各6只。电子直线加速器一次性18 Gy局部照射建立放射性颌下腺细胞损伤模型。于用药后第14天收集唾液，计算唾液流率，检测唾液生化指标。处死后摘取颌下腺组织苏木精-伊红染色（HE染色）镜下观察颌下腺腺体组织形态学变化。 结果 用药后第14天，模型组及低、中、高浓度乌梅喷雾组大鼠体重均低于正常组，差异有统计学意义（P < 0.05）。模型组及低、中、高浓度乌梅喷雾组大鼠唾液流率、Na+、K+、Na+/K+均低于正常组，但差异无统计学意义（P > 0.05）。正常组大鼠腺体细胞排列规则，未见明显病理改变；模型组发生明显炎症细胞浸润，间质中胶原纤维明显增生，发生纤维化；各放射组大鼠颌下腺细胞均出现放射性损伤，与模型组比较，高浓度乌梅喷雾剂组颌下腺腺小叶细胞萎缩程度降低，腺体周围炎症细胞浸润减少，胞浆分泌物增多，但未能恢复至正常组水平。 结论 高浓度乌梅喷雾剂可一定程度上促进大鼠颌下腺放射性损伤细胞病理形态修复，但仍需进一步探讨相关机制。

[关键词] 乌梅喷雾剂；颌下腺；放射性损伤；大鼠

[中图分类号] R782 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）09（c）-0008-04

[Abstract] Objective To observe the influence of Dark Plum Sprays on radiation-induced submandibular gland damage of rats. Methods According to the random number table， a total of 30 healthy Wistar male rats aged 6-7 weeks were divided into normal group （NG）， untreated group （UG）， high-dose Dark Plum Sprays group （HG）， medium-dose Dark Plum Sprays group （MG）， low-dose Dark Plum Sprays group （LG）， each group had 6 rats. The rats were given one-time 18 Gy irradiation locally on the submandibular glands. 14 days later， saliva was collected to calculate the salivary flow rate and detected the biochemical indexes. After that， submandibular glands were draw out. Morphology examination was assessed by HE staining. Results 14 days after administration， the average body weights in UG， HG， MG， LG groups were significantly lower than those in the NG group （P < 0.05）. The salivary flow rate， Na+， K+， Na+/K+ in UG， HG， MG， LG groups were lower than those in the NG group， but there were no statistically significant differences （P > 0.05）. The cells of the Wistar rats in the NG group were regularly arranged， and there were no obviously pathological changes. The cells in UG group presented inflammatory infiltration and the collagen fibrils demonstrated fibrosis with significant hyperplasia. The submandibular gland cells of UG， HG， MG， LG groups had radioactive damage after irradiation. However， the submandibular gland cells of HG group was less atrophy， inflammatory and more cytoplasm secretion than UG. The restoration of submandibular gland cells in HG group were better than UG， but failed to return to normal. Conclusion High-dose Dark Plum Sprays may repair the pathomorphism of submandibular gland cells after radioactive damage， but relevant mechanisms need to be further explored.

[Key words] Dark Plum Sprays； Submandibular gland； Radioactive damage； Ratendprint

头颈部肿瘤是我国华南地区的高发病，尤其是鼻咽癌。放射治疗是头颈部肿瘤主要治疗方法之一，鼻咽癌首选治疗方案是放疗。放射性口干症是头颈肿瘤放疗患者难以避免的放疗并发症。放射性口干症患者常主诉口腔干燥灼热、唇舌疼痛、舌腭粘连、嗅味觉迟钝甚至丧失、吞咽咀嚼困难等，且观察发现，放射性口干症患者极易发生溃疡、口腔真菌感染、口腔上皮萎缩等问题，并常继发或伴有猛性龋齿、继发性唾液腺炎、牙周炎等一系列的口腔疾病，对于头颈部肿瘤患者来说，严重影响其生存质量[1-2]。近年来，由于头颈部肿瘤放疗后患者生存率的提高，患者放疗后的生存质量也日益受重视。放疗时颌下腺一般包被在放射野内，无可避免受到损伤[3]。因此，研究保护和减轻颌下腺损伤，防治放射性口干症的方法和技术备受重视。寻求简单方便、价廉低毒、疗效确切的防治放射性口干症的方法更是刻不容缓。从中医基础理论来看，放射性口干症属火热伤津，从全身治疗角度分析，肿瘤患者本身有肝肾亏虚，放射线属火毒之邪，最易耗气伤阴，因此中医学整体辨证多以酸甘养阴、清热生津为主要治则治疗放射性口干症，颇有疗效。乌梅是酸味药的主要药物之一，甘草是甘味的主要药物之一，乌梅与甘草是酸甘化阴法常用组方药物[4]。乌梅喷雾剂是采用乌梅、甘草配方颗粒研制出的一种新型喷雾剂，根据文献报道，由乌梅与甘草配伍的乌梅喷雾剂不仅能促进正常人唾液分泌，还能缓解胃肠道术后口干症，改善放射性口干症患者主观口干感，具有刺激唾液分泌的作用[5-10]。为进一步观察乌梅喷雾剂对颌下腺的影响，本研究建立大鼠颌下腺放射性损伤模型，给予不同剂量乌梅喷雾剂，观察其对放射性颌下腺损伤的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物

选取健康SPF级雄性6～7周Wistar大鼠30只，体重180～220 g，动物合格证号：CXK（粤）2013-0034，由广州中医药大学实验动物中心提供，分笼饲养，适应环境3 d后开始实验。本研究已通过广州中医药大学实验动物伦理委员会审查。

1.1.2 药物

乌梅喷雾剂由乌梅颗粒剂（广东省一方制药有限公司生产，1.4 g/包，相当于饮片10 g/包）与甘草颗粒剂（0.5 g/包，相当饮片3 g/包）按饮片比例15∶3 g、30∶6 g、60∶12 g分别用20 mL温开水溶解，倒入喷雾小瓶，对应配制成低、中、高浓度的乌梅喷雾剂。每次用前新鲜配制。

1.1.3 试剂与仪器

水合氯醛，毛果芸香碱（大连美仑生物技术公司，货号MB5259），4%多聚甲醛，Eppendrof管（永津生物科技有限公司），移液器枪头，可调式移液器（德国艾本德），美国医用Varian23EX直线加速器，Na+、K+试剂盒（南京建成生物公司），分光光度计（上海天美公司，型号UV1100II），自制手术台，手术器械。

1.2 方法

1.2.1 分组与造模

大鼠采用随机数字表法分为正常组，模型组，低、中、高浓度乌梅喷雾组，每组各6只。分组后进行放射造模。大鼠腹腔注射10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉，手术架上固定，仅颌下腺区暴露在照射野（图1），余部位用铅砖防护，予一次性给予18 Gy放射线照射（能量为9 MV，剂量率为3 Gy/min，广东省中医院大学城分院放疗科技术提供）。正常组只麻醉不照射。

1.2.2 给药方法

正常组正常饮食；模型组照射后正常饮食；低、中、高浓度乌梅喷雾组正常饮食外，辐射当天开始给予低、中、高浓度乌梅喷雾剂口腔喷雾。给药均在餐前进行，每天3次（8∶00、12∶00、16∶00），一人抓取大鼠，一人口腔喷雾给药，均在吸气时候喷药，每次喷两下（0.1 mL）。给药至造模后14 d取材。

1.2.3 指标检测

1.2.3.1 一般情况 观察大鼠精神状态、毛色、体重。

1.2.3.2 唾液流率及生化指标 采用移液器收集大鼠刺激性唾液（图2）。方法：腹腔注射10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉后将大鼠固定于自制手术架，颈部皮下注射0.2%毛果芸香碱（2 mg/kg）刺激唾液分泌，注射毛果芸香碱后开始计时，将唾液收集在已称重的Eppendorf管內，收集20 min。假设唾液比重是1.0 g/mL，以重量代表体积计算唾液流率。将已收集的唾液于-20℃冻存，待全部标本收集完全后采用比色法检测K+、Na+含量。

1.2.3.3 病理切片 收集唾液后脱臼法处死大鼠，取颌下腺组织，4%多聚甲醛溶液室温固定，苏木精-伊红染色，光学显微镜下观察病理改变。

1.3 统计学方法

采用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况

各组大鼠均成活于整个实验周期。放射后，大鼠精神状态较差，毛发欠光泽。照射当天各组大鼠体重差异无统计学意义（P > 0.05），至照射后14 d，即实验周期结束，模型组及低、中、高浓度乌梅喷雾组大鼠体重均低于正常组，差异有统计学意义（P < 0.05），但三个用药组与模型组大鼠体重比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表1。

2.2 唾液流率及生化指标

模型组及各浓度乌梅喷雾组大鼠唾液流率、Na+、K+、钠钾比均低于正常组，但经方差分析，各组间差异均无统计学意义（P > 0.05）。见表2。

2.3 颌下腺病理组织学变化

正常组HE染色切片镜下可见腺体结构清晰，排列规则，腺泡细胞呈立方形，顶部胞质中有较多嗜酸性分泌物，核位于基底部。模型组大鼠腺体被间质结缔组织分割成小叶，腺泡细胞明显萎缩，可见核固缩，胞浆中分泌物明显减少，有明显炎症浸润，间质中胶原纤维明显增生发生纤维化。与模型组比较，低、中、高浓度乌梅喷雾组大鼠随着浓度的递增，颌下腺细胞萎缩及浸润程度均减少，胞浆分泌物增多。见图3。endprint

3 讨论

放射线会破坏唾液腺组织，使其血管和腺泡出现损伤，唾液分泌减少，进而使患者放疗后出现严重口干症状。一次性单一剂量放射要比相同剂量分割放射所致的唾液腺损伤严重，因此现在关于唾液腺治疗的研究多采用一次性放射性照射。本研究采用一次性18 Gy电子线放射建立大鼠颌下腺损伤模型[11]，通过腺体病理组织学观察乌梅喷雾剂是否对腺泡细胞起保护作用[12]。乌梅喷雾剂干预14 d，病理切片显示，相对于模型组，高浓度乌梅喷雾剂组的颌下腺腺小叶细胞萎缩程度降低，腺体周围炎症细胞浸润减少，胞浆分泌物相对较多，提示高浓度乌梅喷雾剂能促进大鼠放射性损伤颌下腺细胞形态修复，但具体作用机制仍需探究。

放射损伤后腺泡细胞合成分泌唾液的能力下降，导致唾液流率下降。邢红艳[13]实验表明，照射后小鼠唾液流率明显下降。本研究结果显示，各组大鼠唾液流率差异无统计学意义（P > 0.05）。与国外放射后致腺体唾液流率减少的研究结果不符[14-15]。推测可能原因：①乌梅喷雾剂可刺激正常无损伤腺体[7，10]，但对促进放射性颌下腺损伤唾液分泌效果不明显，可进一步比较乌梅喷雾剂对正常和各种损伤唾液腺的刺激作用。②唾液收集方法不严谨，基于唾液量收集误差极易影响唾液流率分析。然而，大鼠唾液腺导管较小，经口内颌下腺导管口直接插管法收集大鼠颌下腺唾液可行性不高，不易掌握[16]。

放射性口干症患者唾液分泌量、性质和成分发生改变。本研究中大鼠放射性损伤后唾液Na+、K+含量降低，但放射后第14天，各组唾液Na+、K+含量差异无统计学意义（P > 0.05）。唾液腺小叶内导管是皮质激素的作用部位，在该处激素可促进Na+吸收和K+排出，因此伴有唾液Na+/K+比值的相应变化。国内外研究认为，Na+/K+比值不仅可以作为醛固酮分泌的指标，还能反映整个肾上腺皮质功能的改变[17-18]。本研究显示乌梅喷雾剂对大鼠颌下腺放射性损伤后早期唾液成分无影响，后续研究可增加乌梅喷雾剂对大鼠颌下腺放射性损伤不同时期的观察，以分析其有效作用时间。

乌梅喷雾剂居家方便，价廉低毒，临床效果显著，但其防治放射性口干症机制研究不足，难以推广，极大局限了其使用范围。若乌梅喷雾剂能促进大鼠颌下腺放射性损伤细胞形态修复，则可为其防治放射性口干症提供理论依据。本研究结果提示高浓度乌梅喷雾剂可一定程度上促进大鼠颌下腺放射性損伤细胞病理形态修复，但机制仍需进一步明确，亟需加强基础研究，以阐明作用机制，为临床推广应用提供充分依据。

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（收稿日期：2017-06-25 本文编辑：程 铭）endprint