黄曲霉毒素M1酶联免疫吸附检测方法的建立*

卢晓霞 谢海军 宋 崴 赵 邑 何永吉，2***（

1山西省生物研究所，山西太原 030006）（2山西省农业科学院农产品加工研究所，山西太原 030006）

黄曲霉毒素M1酶联免疫吸附检测方法的建立*

卢晓霞1**谢海军1宋 崴1赵 邑1何永吉1，2***（

1山西省生物研究所，山西太原 030006）（2山西省农业科学院农产品加工研究所，山西太原 030006）

黄曲霉毒素是一种由黄曲霉（Aspergillus flavus） 和寄生曲霉（A.parasiticu）产生的小分子代谢产物，具有很强的致癌、致畸、致突变作用，严重威胁食品安全。黄曲霉毒素具有6种结构极为接近的类型，分别为B1、B2、G1、G2、M1和M2型。其中黄曲霉毒素M1（Aflatoxin M1，AFM1）主要存在于蛋、奶中，是黄曲霉毒素B1的次级羟基化代谢物，高温等常规操作难以将其破坏，具有很大的危害性，是目前食品污染监测的重点。

酶联免疫吸附（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）检测方法具有快速、敏感、易于标准化的优点，是目前检测AFM1的首选方法。目前已建立多种检测AFM1的ELISA方法，然而仍无法满足国际上对AFM1限量标准不断更新的要求，并存在敏感性差、操作繁琐、标准化程度低等诸多问题。本研究通过合成AFM1-KLH和AFM1-OVA完全抗原，分别制备了AFM1单克隆抗体和多克隆抗体，并利用单克隆抗体和多克隆抗体建立夹心ELISA定量检测方法，为深入研究AFM1的生物学功能奠定了基础。

1 材料和方法

1.1 材料

黄曲霉毒素M1、B1、B2、G1和G2标准品，弗氏免疫佐剂，抗体亚类鉴定试剂盒，Sigma公司；钥孔血蓝蛋白（KLH）和卵清蛋白（OVA）、山羊抗小鼠IgG-HRP、山羊抗兔IgG-HRP、AP标记的羊抗鼠 IgG、PEG1500、邻苯二胺 （OPD）、NBT/BCIP显色剂，南京金斯瑞公司；健康雌性Balb/c小鼠及新西兰大白兔，北京维通利华实验动物有限公司。其他常规试剂全部为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 AFM1半抗原、完全抗原合成

按照参考文献［3］中的方法，采用琥珀酰亚胺法将AFM1转化成AFM1肟化物（AFM1O）半抗原，然后利用碳化二亚胺法（EDC）与载体蛋白KLH和OVA反应，有机合成完全抗原AFM1-KLH和AFM1-OVA。

1.2.2 AFM1单克隆抗体制备

按照经典杂交瘤技术方法，以AFM1-KLH为免疫抗原，采用标准免疫程序免疫5周龄健康雌性Balb/C小鼠，以AFM1-KLH作为包被抗原，采用间接ELISA法监测免疫效果；采用PEG1500化学法完成免疫后脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞的细胞融合，以 AFM1-OVA为筛选抗原，联合间接ELISA方法和有限稀释法筛选阳性克隆，最后采用扩大培养方法生产单克隆抗体。上清经ProteinA亲和柱层析后收集洗脱液，利用聚丙烯酰氨凝胶电泳（SDS-PAGE）和蛋白质印迹法（Western blot）鉴定。

1.2.3 AFM1多抗血清的制备

AFM1-KLH作为免疫抗原，按照标准免疫程序，分别与弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂充分乳化后，经皮下多点免疫。初次免疫量控制在0.8 mg/只，其余3次免疫量均减半，8周后从颈动脉采全血。以AFM1-OVA为包被抗原，按照间接ELISA法检测血清效价。收获的抗血清交换至磷酸缓冲液（PBS）后，同样采用ProteinA亲和柱层析分离纯化收集洗脱液，利用SDS-PAGE和Western blot鉴定。

1.2.4 双抗体夹心ELISA方法的建立

制备的AFM1单克隆抗体经碳酸盐包被液包被后，铺96孔板，100 μL/孔；次日经PBST（即PBS缓冲液中加入吐温-20配制而成）洗涤后加入5%脱脂奶粉封闭液封闭；洗涤后加入AFM1-OVA标准蛋白或者待测样品，37℃孵育反应1 h；加入AFM1兔多抗，100 μL/孔，37℃孵育反应1 h；加入商品化的HRP标记的羊抗兔IgG，100 μL/孔，37℃孵育反应1 h；加入TMB底物显色液，室温下避光反应，加入30 μL/孔、2 mol/L H2SO4终止反应后，于450 nm处测定。

1.2.5 ELISA反应条件优化

采用方阵滴定法对包被单克隆抗体浓度、兔多抗浓度、酶标二抗稀释度进行优化。

1.2.6 标准曲线建立

以优化的 ELISA参数为试验条件，以AFM1-OVA为标准蛋白，依次测定标准蛋白质量浓度为0.1 ng/mL、0.5 ng/mL、1.0 ng/mL、2.0 ng/mL、4.0 ng/mL、8.0 ng/mL、16.0 ng/mL、32.0 ng/mL、64.0 ng/mL、128.0 ng/mL、256.0 ng/mL时在450 nm处的光密度（OD）值，以AFM1-OVA标准蛋白浓度为横坐标，450 nm处的OD值为纵坐标建立标准曲线。分析标准曲线的检测范围、最低检测限、批间和批内变异系数，对所建立的ELISA方法进行综合评价。

1.3 结果

1.3.1 AFM1单克隆抗体的制备及鉴定

采用细胞融合技术获得一株可稳定分泌抗AFM1抗体的杂交瘤细胞株，经Western blot检测该抗体可以特异性结合AFM1抗原，结果见图1。抗体亚类鉴定结果显示该抗体属IgG1。经体外细胞培养产生抗体后，其效价可达1∶5×103。细胞培养上清经 Protein ng/mL A亲和层析纯化后，经SDS-PAGE检测，结果见图2。由图2可知，利用体外细胞培养，并经亲和层析纯化后，可获得较纯的AFM1单抗。

1.3.2 AFM1多克隆抗体的制备及鉴定

以AFM1-KLH免疫新西兰大白兔收获多抗血清后，经Protein A柱分离纯化（见图2），抗体效价可达1∶105，由Western blot检测结果可知，其同样具有特异性识别AFM1抗原的能力，且无其他假阳性结果出现（见图1）。

图1 Western blot检测单抗和多克隆抗体的特异性

图2 SDS-PAGE检测单抗和多抗

1.3.3 标准曲线的建立

方阵滴定法确定了ELISA各反应最优条件，以AFM1-OVA为标准蛋白建立了标准曲线，结果见图3。其标准曲线方程为 y=0.004 4x+0.002 1（R2= 0.992 2），其中x为AFM1-OVA标准蛋白质量浓度、y为OD450值，工作范围为0.5 ng/mL～128 ng/mL；批内、批间差分别为6.21%和5.23%，均小于10%，重复性良好，最低检测限为0.5 ng/mL。

图3 夹心ELISA法的标准曲线

3 讨论

AFM1作为一种目前奶制品最为重要的检测项目之一，其检测结果直接关系到奶制品的质量安全，因此，急需建立一种可以适应监管一线的方法，从而快速、准确、简便地完成对AFM1的监测。利用ELISA方法完成AFM1检测是目前该领域的主要方向之一。而ELISA检测的关键是获得具有特异性的高活性抗体，包括单克隆抗体和多克隆抗体。目前关于AFM1单克隆抗体和多克隆抗体的制备已多有报道，然而其特异性、敏感性以及稳定性均差强人意。建立一种可适用于生产实际的应用性检测方法，不仅要选择标准化的检测抗原建立标准曲线，而且要选择具有高度特异性的抗体来防止假阳性的出现，同时要经过优化筛选提高方法的准确度和重复性，才能真正建立一种具有实际可操作性的ELISA检测方法。

本研究制备了完全抗原AFM1-KLH、AFM1-OVA，大大提高了抗原的免疫原性，通过双抗原结合制备了高特异性的单克隆抗体，降低了与其他黄曲霉毒素种类的交叉反应性；通过免疫新西兰大白兔，制备了与单克隆抗体不同种属的多克隆抗体；最终通过ELISA方阵滴定法优化试验条件，建立了敏感、准确、标准化的单抗-多抗夹心ELISA方法，为替代国外进口试剂，研发自主知识产权的AFM1检测试剂奠定基础。

［1］YOSHIZAWA T，YAMASHITA A，LUO Y.Fumonisin occurrence in cornfrom high and low risk areas for human esophageal cancerin China［J］.Appl Environ Microbiol，1994，60（5）:1 626-1 629.

［2］裴世春，郑丽娜，唐彦君，等.黄曲霉毒素M1检测ELISA条件的优化及应用研究［J］.黑龙江八一农垦大学学报，2008，20（5）:57-60.

［3］王勇.黄曲霉毒素M1单克隆抗体的制备及其免疫学特性研究［J］.大众标准化，2016（4）:61-63.

Development of enzyme-linked immunosorbent assay for AFM1detection*

LU Xiaoxia1**XIE Haijun1SONG Wei1ZHAO Yi1HE Yongji1，2***1（Biology institute of Shanxi，Shanxi Taiyuan 030006，China）
2（Institute of agricultural products processing，Shanxi academy of agricultural sciences，Shanxi Taiyuan 030006，China）

建立单抗-多抗夹心酶联免疫吸附（ELISA）检测方法，为黄曲霉毒素M1（AFM1）的快速检测及研究奠定基础。采用有机合成法将AFM1转化成半抗原AFM1肟化物（AFM1O），进一步与载体蛋白钥孔血蓝蛋白（KLH）和卵清蛋白（OVA）偶联合成完全抗原AFM1-KLH和AFM1-OVA；以AFM1-KLH为免疫抗原、AFM1-OVA为筛选抗原，采用杂交瘤技术制备AFM1单克隆抗体，以AFM1-KLH免疫新西兰大白兔制备兔多克隆抗体；以AFM1-OVA为标准蛋白，制备的单克隆抗体为捕获抗体，纯化的兔多克隆抗体为检测抗体，商品化HRP标记的山羊抗兔IgG作为检测二抗，采用方阵滴定法优化各步检测条件，得到最佳试验条件，建立AFM1夹心ELISA检测方法。标准曲线方程为y=0.004 4x+0.002 1(R2=0.992 2)，检测范围0.5 ng/mL～128 ng/mL；最低检测限为0.5 ng/mL，批内和批间差均小于10%，重复性良好。

AFM1；抗体；ELISA

Objective development of enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)for detection of AFM1.Methods the hapten AFM1O was synthesized from derivatives of AFM1by a chemical process.Further,complete antigen AFM1-KLH and AFM1-OVA were synthesized by couple AFM1with KLH and OVA respectively.AFM1-KLH and AFM1-OVA were subsequently used as immunogen and detecting antigen to screen mAb produced by hybridoma cells agains and pcAb produced from antiserum.Then a sandwich ELISA for determination of AFM1was developed using the AFM1-OVA as standard protein,in which the monoclonal and ployclonal antibody previously produced were chosen as a capture antibody and detect antibody,respectively.The results showed the standard linear equation,y=0.004 4x+0.002 1（R2=0.992 2）,was established for the determination of AFM1concentration with the valid rang of 0.5～128ng/mL.The susceptibility of the ELISA was about 0.5 ng/mL of AFM1concentration.

AFM1；antibody；ELISA

TS207

A

1673-6044（2017）02-0058-03

10.3969/j.issn.1673-6044.2017.02.016

山西省应用基础研究项目（201601D102041）。

**卢晓霞，女，1984年出生，2004年毕业于山西大学生物工程专业，助理研究员。

***何永吉，通讯作者，E-mail：heyongji_919@163.com.

2017-03-03