Plackett-Burman设计和响应面法在食品专业综合实验教学中的应用*

蒋 晗 赵 进 方结红 黄光荣 李红亮 潘家荣

（中国计量大学浙江省海洋食品品质及危害物控制技术重点实验室，浙江杭州 310018）

·应用研究·

Plackett-Burman设计和响应面法在食品专业综合实验教学中的应用*

蒋 晗**赵 进 方结红 黄光荣 李红亮 潘家荣

（中国计量大学浙江省海洋食品品质及危害物控制技术重点实验室，浙江杭州 310018）

“食品专业综合实验”是学生在学习了食品学科基础课程、专业基础课程和专业课程，并具有了一定基础理论体系和专业基本操作技能后进行的实践性教学环节，是培养食品专业学生“试验设计能力、操作能力、问题总结能力和协调交流能力”的一门专业综合实验课程，也是食品专业的必修课。

中国计量大学食品专业综合实验由学生自行组队，每队配备一名食品专业指导老师，开展时间为7周，考核形式由试验报告、试验表现和PPT展示3部分组成。它打破了传统教学中试验课程作为教学课程的补充与辅助模式，独立成课，这在提高教学质量，加强学生专业综合能力和培养创新创业意识方面起到了不可替代的作用。选题由教师和学生双向选择，根据教师的研究方向以及学生的专业方向、未来发展方向和兴趣点，共同探讨试验的选题和内容，力求做到点面结合、基础知识和专业知识有机结合，并能有效涵盖学科的典型试验操作与设计分析技能。

本文以食品专业综合试验课题“产乳酸菌细菌素基因工程菌发酵条件的优化”为例，介绍了Plackett-Burman（P-B）设计和响应面法在试验设计和优化中的应用。该课题由6位食品专业的大四学生完成，由食品微生物技术方向指导老师指导。

本试验所用基因工程菌pET32a（+）-plnc8 α-BL21（DE3）的前期构建工作由指导老师完成，若实验课时充分或为食品生物技术专业小组，可在指导老师的帮助下尝试自行构建。本试验的优化过程为：首先进行融合蛋白的诱导表达，以可溶性融合蛋白的含量为指标，利用P-B试验设计筛选出最有影响的独立因素，然后用Box-Behnken Design（BBD）响应面试验找到最优试验参数，并对模型进行验证，以得到基因工程菌的最优发酵条件。

1 试验步骤与结果

1.1 P-B设计和响应面法的基本原理和特点

P-B设计是建立在平衡的非完全区组（Balanced incomplete block）基础上的，通过N个试验（N为4的倍数）来分析N-1个变量的两水平试验设计方法。和传统的单因素试验相比，可以利用最少的试验次数，快速有效地在众多考察因素中列出重要性排名，找出主要影响因素。

响应面法是通过具有代表性的局部各点进行试验，回归拟合全局范围内因素与结果的函数关系，建立模型，取得各因素的最优水平值。和传统的正交试验相比，可以通过建模，在整个区域获得试验因素和响应目标之间的函数关系式，以获得变量的最优组合和响应值的最优值。

P-B设计和响应面法是近年来国际上较常用的理论优化方法，现已广泛应用于食品工艺配方设计和工艺条件优化等领域。

1.2 融合蛋白的诱导表达

融合蛋白的诱导表达采用常规方法。目标蛋白特异性条带通过SDS-PAGE电泳检验，利用Photoshop CS6软件分析灰度值确定蛋白含量。通过上述试验，发现每升培养基产可溶性融合蛋白约4 mg，产包涵体蛋白约26 mg，由此可见，大部分融合蛋白经诱导表达后，以包涵体的形式存在。经查阅文献，发现在原核表达的过程中，当重组蛋白在宿主系统中高水平表达时，可能因为蛋白折叠太快，而折叠过程中所需要的酶或辅助因子供应不足，无法形成正确的次级键，从而形成包涵体。包涵体无论在诱导表达还是进一步分离纯化时，步骤都比可溶性蛋白要复杂繁琐，纯化成本也高。故结合文献和实验室蛋白诱导表达经验，利用P-B试验设计法和BBD响应面试验对基因工程菌的发酵条件进行优化，以期得到最大量的可溶性融合蛋白。

1.3 P-B设计法

根据前期试验，确定P-B试验设计的因素和水平（表1），评价指标为PLNC8α可溶性融合蛋白的浓度。

表1 P-B试验设计因素水平及编码

在本研究采用的方法和条件下，采用Minitab软件对可溶性融合蛋白诱导表达的P-B试验结果（下页表2）进行方差分析。从方差分析结果（表3）可以看出，影响PLNC8α可溶性融合蛋白产量的因素重要性排序为：IPTG浓度>初始pH>IPTG诱导温度>IPTG诱导时间>装液量>摇床转速。其中，取排名前三的因素IPTG浓度、初始pH和IPTG诱导温度进行响应面分析，以确定其所对应的最优水平。IPTG诱导时间、装液量和摇床转速的确定根据效应的正负和节约成本的原则，参考相关文献中关于可溶性蛋白表达的一般条件，将其控制为IPTG诱导时间12 h；装液量：5 mL/250 mL；摇床转速160 r/min进行试验。

表2 PLNC8α的P-B试验设计与响应值表

表3 PLNC8α的P-B试验分析结果方差分析

1.4 响应面法

根据P-B试验结果，选取初始pH、IPTG浓度和IPTG诱导温度3个因素为自变量，PLNC8α可溶性融合蛋白的浓度为响应值，利用BBD响应面设计法对以上3个条件进行进一步优化，试验因素及编码水平见表4。

表4 BBD响应面设计试验因素和编码水平

在设定的方法和条件下，利用Design-Expert软件对PLNC8α的BBD响应面试验结果（下页表5）进行方差分析及二次多项回归拟合（下页表6），得到PLNC8α可溶性融合蛋白产量对IPTG浓度、初始pH和IPTG诱导温度的多元回归模型：

Y=22.5+1.075A+0.25B+0.7C-0.35A×B+0.1A× C-0.05B×C-1.63A2-0.15B2-0.48C2，

其中，Y为最大响应值的预测值；A、B、C分别为IPTG浓度、初始pH、IPTG诱导温度的编码值。

该二次模型多元相关性系数R2=0.985 7，表明仅1.43%的变异不能由此模型解释；回归模型P值（prob>F）=0.000 4，表明模型是显著的，失拟项P 值为0.261 7，表明失拟不显著，模型没有失拟现象。由模型可得，理论上当IPTG诱导浓度为0.46 mmol/L，初始pH为7.34，诱导温度为19.36℃时，预测的最大响应值为22.97 mg/L。为验证试验结果，将诱导温度修正为19℃，在该条件下进行重复试验，结果为23.04 mg/L±0.92 mg/L，与预测值接近，证明模型有效。PLNC8α的交互影响响应面见下页图1。由图1可形象地看出各因素的交互作用对响应值的影响。经过优化，可溶性融合蛋白产量从优化前的每升培养基产4 mg提升到23.04 mg±0.92 mg，效果显著。

2 试验教学效果分析

通过本综合试验，学生能掌握P-B设计和响应面方法的基本原理及操作方法。对于第一次接触的同学，指导老师在P-B试验因素的选择上给予重点指导。P-B试验中，需对每个因素选择合适水平，尽量涵盖该因素允许的最大空间。这就需要有经验的指导老师，根据前期试验基础并结合相关文献，与同学们一起选出因素并确定因素的水平范围。同时，在试验中需要规范每位同学的试验操作，避免因其他因素影响使试验结果失真。同理，在利用P-B试验选出关键因素后，响应面的编码水平选择也需指导老师把关。学习Design-Expert软件的使用。整个试验完成后，学生对P-B设计和响应面方法从理论到应用已十分熟悉，同时也掌握了试验数据的处理方法和统计分析方法。在整个试验过程中，6位同学需查阅资料，设计试验方案，统筹安排，提高试验设备利用率，及时处理试验数据，提交试验报告，并进行PPT答辩，通过实训，学生的试验设计能力、操作能力、问题总结能力和协调交流能力均得到提高，学生的试验规范性也得到了提高，这些为毕业论文的设计以及毕业后从事相关工作打下了良好的基础。

表5 PLNC8αBBD响应面试验设计及结果

表6 PLNC8α的回归方程方差分析

图1 PLNC8α的交互影响响应面图

加强师生良性互动，让学生有更多机会进入科研实验室锻炼。在本实验教学过程中，以学生为主体，指导老师采用启发式教学和讨论式教学，以多种方法和形式启发引导学生自主学习，独立分析、思考和解决问题，指导老师起到引领方向和答疑解惑的作用。试验中，因涉及到的发酵条件变量较多，指导教师应开放科研实验室以开展工作，并积极鼓励本科生就试验细节问题请教科研实验室的研究生，以形成良性互动。

鼓励指导教师将最新的科研项目提炼成食品专业综合实验教学内容。若食品专业综合实验项目采用每年固定的题目，更新少、增补慢，会影响教师的指导积极性以及学生的试验设计兴趣。若指导教师每年更新综合实验的题目，又需耗费大量精力。因此鼓励指导教师结合自身科研项目，提炼出适合学生的综合实验教学内容。从而使教师指导学生更专业，也愿意投入更多精力。学生不仅可以从专业综合实验中得到锻炼，而且还能提高学习和科研兴趣。同时，学生们集思广益也能为指导老师的科研项目提供新思路。

3 结语

本项目作为食品专业综合实验教学内容之一，充分考虑到综合实验的完整性，从融合蛋白的诱导表达这一基础实验入手，到提出问题、设计系列优化方案等均需要更高要求的综合性和研究探索性试验，都取得了良好的教学效果。一方面，学生通过该试验，全面掌握了P-B设计和响应面优化方法，今后可举一反三应用在食品工艺、质量控制、安全检测等需要条件优化的试验中。同时了解和掌握基因工程菌构建、蛋白诱导表达、大肠杆菌培养、SDS-PAGE电泳等专业试验技能和常用仪器的使用方法，拓宽了学生的专业视野，提高了学生的专业综合能力，为今后进一步深造和从事相关工作打下了基础。另一方面，试验内容提炼于指导老师的最新科研项目，具有一定的科研探索性和趣味性，学生能够在指导老师的带领下主动提出问题，分析问题和解决问题，为学生科研能力和专业综合素养的提高提供帮助，达到了食品专业人才培养的效果，为食品专业相关实验教学改革提供参考与借鉴。

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Application of plackett-burman design and response surface methodology in the food speciality comprehensive experiment teaching*

JIANG Han*ZHAO Jin FANG Jiehong HUANG Guangrong LI Hongliang PAN Jiarong
（China jiliang university key laboratory of marine food quality and hazard controlling technology of Zhejiang province，Zhejiang Hangzhou 310018，China）

为实现食品专业综合实验选题和内容点面结合、基础知识和专业知识有机结合，有效涵盖学科方向的典型试验操作与试验设计分析的目标，设计了课题“产乳酸菌细菌素基因工程菌发酵条件的优化”，将近年来广泛应用于食品工艺条件优化等领域的理论优化方法Plackett-Burman设计和响应面法应用到食品专业综合实验教学项目中，优化基因工程菌的发酵条件，以期得到最大量的可溶性融合蛋白。食品专业学生通过此项专业综合实验训练，可熟练掌握该优化方法，并可应用在食品工艺、质量控制、安全检测等需要条件优化的试验方案中。该项目可为食品专业相关实验教学改革提供参考与借鉴。

Plackett-Burman设计；响应面法；食品专业综合实验教学

To achieve the aims of proper combination of basic and professional knowledge,effective coverage of the typical experimental operation,designing and analysis skills of subject content,and make experimental subject selection and content integrate point with face.The subject of"optimization of fermentation conditions of lactic acid bacteria bacteriocin-producing genetically engineered bacteria"has been designed.The plackett-burman design and response surface methodology were used to obtain the maximum yields of soluble fusion proteins.According to the training,food science undergraduates can be familiar with the optimization methods and can apply the optimization methods to experiments including food technology,quality control and safety detection and so on.This project can provide references for experimental teaching reform of food speciality.

plackett-burman design；response surface methodology；food comprehensive experiment teaching

TS210.1

A

1673-6044（2017）02-0010-05

10.3969/j.issn.1673-6044.2017.02.005

浙江省高校实验室工作研究项目（YB201654）。

**蒋晗，女，1987年出生，2017年毕业于浙江工商大学食品科学专业，实验师。

2017-04-11