月季‘云粉’花粉母细胞减数分裂的初步研究

陈 敏，王园媛，黎 霞，李慧敏，吴 旻，张 颢，王其刚，张 婷，蹇洪英*

(1.云南省农业科学院花卉研究所/云南省花卉育种重点实验室/国家观赏园艺工程技术研究中心，云南 昆明 650200；2.云南师范大学文理学院，云南 昆明 650222)

月季‘云粉’花粉母细胞减数分裂的初步研究

陈 敏1，王园媛2，黎 霞1，李慧敏1，吴 旻1，张 颢1，王其刚1，张 婷1，蹇洪英1*

(1.云南省农业科学院花卉研究所/云南省花卉育种重点实验室/国家观赏园艺工程技术研究中心，云南 昆明 650200；2.云南师范大学文理学院，云南 昆明 650222)

【目的】本文探讨了切花月季自育品种‘云粉’作父本时结籽率差异显著且较低的原因。【方法】以改良的制片法对 ‘云粉’的花粉母细胞减数分裂各个时期进行了观察。【结果】观察‘云粉’花粉母细胞减数分裂的最佳时期是当花药由淡绿色转变为淡黄色、花蕾横径为1.03～1.07 cm、纵径为2.9～3.4 cm大小时；在同一花药中,花粉母细胞的减数分裂并不同步,可以观察到不同时期的分裂相。花粉母细胞在减数第1次分裂过程中存在单价体、三价体、染色体桥等异常现象，减数第2次分裂末期观察到三分体和二分体。【结论】‘云粉’因花粉母细胞减数分裂过程存在异常分裂现象，从而产生2n雄配子，在一定程度上降低了其作父本时的结籽率。

月季；花粉母细胞；减数分裂；2n雄配子；结籽率

【研究意义】月季(RosahybridaL.)是蔷薇科(Rosaceae)蔷薇属(RosaL.)植物，是重要的观赏植物，也是世界第一大切花[1-2]。目前，国内占有市场份额的切花月季品种除经芽变选育的‘金辉’[3]外，几乎全部来自国外。缺乏具有市场占有率的自主知识产权的切花月季品种已成为中国月季产业发展的严重障碍。随着UPOV1991文本的逐渐实施，通过杂交选育获得月季新品种就显得尤为紧迫[4]，然而月季杂交育种中却存在杂交不亲和、杂种高度不育[5]、以及很多组合不结实或结实率较低等问题，严重影响了育种进程[6]。植物育种归根到底是对物种(品种)染色体及染色体外遗传结构的改良[7-8]。研究月季的花粉母细胞(PMCs)的减数分裂行为，可了解各品种或种在细胞学层面的遗传特性，为杂交亲本的选择、杂交后代和新品种的鉴定等提供首要依据[9]。【前人研究进展】自20世纪以来，研究人员对蔷薇属植物的倍性和细胞核型进行了广泛的研究[10-27]，但减数分裂方面的研究较少。Lim等[21]以rDNA 为探针的染色体荧光原位杂交技术(FISH)对狗蔷薇(R.canina， 2n=5x=35)的体细胞和花粉母细胞(PMCs)染色体进行了分析，证明狗蔷薇只有1对同源染色体，因在减数分裂过程中稳定地发生不等分裂而能进行有性生殖。Ma等[21]对金樱子及其杂交子代的减数分裂进行了观察和分析。罗玉兰等[22]对粉团蔷薇(R.multifloraThunb.var.cathayensisRehd.)进行减数分裂研究的结果表明该变种为部分同源三倍体。 月季品种‘云粉’是从‘奶油妹’ב木瓜粉’的杂交后代群中选育而成的，是国内首个通过杂交选育并授权的切花月季新品种[28-29]。【本研究的切入点】研究发现‘云粉’作父本时各组合结实率差异极显著(0～47.6 %)，单花结籽数很低(0～6.47粒)[30]。【拟解决的关键问题】本研究对‘云粉’PMCs的减数分裂过程进行观察，旨在了解‘云粉’PMCs的减数分裂行为是否是导致其作为父本时结实率差异明显及结籽数低甚至为0的原因，为利用‘云粉’进行杂交育种提供细胞学方面的理论依据，同时也为研究其他蔷薇属植物的PMCs减数分裂行为提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 实验材料

‘云粉’为灌木，植株直立，花单生于茎顶，花梗长而坚韧，阔瓣大花型，外花瓣比内花瓣稍浅，浅粉色，内花瓣浅粉色，花瓣23～32枚(图1-A)；切枝长度60～80 cm，茎的中上部近无刺，茎的中下部皮刺较多；年产量20枝/株；瓶插寿命8～10 d[28]。实验材料保存在位于昆明市北郊的云南省农业科学院花卉研究所月季种质资源圃内(图1-B)。

1.2 实验方法

1.2.1 取材及预处理 于4月下旬‘云粉’现蕾时开始，每天上午9:00时进行采样。从小到大依次递增选取处于不同发育阶段的幼嫩花蕾若干(图2-A)。剥去花蕾的萼片和花瓣(图2-B)，去掉雌蕊后用CarnoyⅠ(无水乙醇∶乙酸=3∶1，V∶V)固定24～72 h。固定好的材料用75 %的乙醇清洗后再用75 %的乙醇于4℃保存。

图1 切花月季品种‘云粉’(A:花; B:田间保存)Fig.1 Cut rose Rosa ‘Yunfen’ (A: Flower; B: Resources in the nursery)

图2 不同发育阶段的花蕾及对应的花药形态 (A: 花蕾 B：花药)Fig.2 Buds and their corresponding anthers at different developing stage (A:Buds; B:Anthers)

A：常规压片法，杂质多；B：改良压片法，细胞分散好，视野中杂质少A: Conventional method with more impurity substances; B: Improved method with less impurity substances and much more scattered cells图3 不同制片法显微观察的视野效果Fig.3 Visual field of different dying and pressing method in the microscope

1.2.2 染色及压片 采用改良卡宝品红染色法。将保存的花药用清水冲洗后放入0.1 %的H Cl中，在室温下酸解20 min。清水漂洗后再用卡宝品红染色1 h，取出染好色的花药再次用清水冲洗。将洗净的花药置于洁净的载玻片上，滴1～2滴40 %乙酸脱色，切碎花药盖上盖玻片并轻敲盖玻片使细胞分散。最后封片供镜检。

1.2.3 显微观察 临时片在Olympus CH300 显微镜40×下镜检,在Nikon E800 显微镜100×下用DXM1200型显微图像捕捉系统拍照记录减数分裂的整个过程及其中出现的裂常分裂现象。

2 结果与分析

2.1 制片

常用的制片技术是挑取未经酸解的花药到洁净的载玻片上，滴上染料，然后挑开花药使花粉母细胞释放出来快速染色后直接压片。这种方法快捷简便，但制出的片子背景有较多杂质，影响观察(图3-A)。对于月季来说，由于花药较小且较硬，不易将花粉母细胞(PMCs)从没有酸解过的花药中挤压出来，压片较困难。本实验在染色前先进行酸解，使花药变得柔软，有利于PMCs散出及后期的染色和压片，制片中细胞分散较好，便于观察(图3-B)。

2.2 花粉母细胞减数分裂与花蕾形态特征的相关性

‘云粉’PMCs减数分裂与花蕾的发育程度相关，包括花蕾横径、花萼形态，尤其与花药色泽的关系最大，与花蕾纵径没有明显关系。其减数分裂是在花蕾横径为1.03～1.07 cm、花药由淡绿色(图2-6)转变为淡黄色(图2-5)之间进行的，此时萼片尚未开裂。当花药处于黄绿色时，无论花蕾长/短(纵径2.9～3.4 cm)，PMCs都处于减数分裂阶段；反之，当花药处于淡绿色时，即使花蕾较大，花粉母细胞也未进行减数分裂(表1)。

2.3 花粉母细胞减数分裂行为

通过对20个以上体细胞的染色体计数表明‘云粉’为四倍体(2n=4x=28)。本研究中，‘云粉’的花粉母细胞(图4-A，左)相对药壁细胞(图4-A,右)等体细胞来说较大较圆，染色程度也比体细胞更深，易于区分。通过对其减数分裂后期Ⅱ的染色体观察(图4-B)，进一步证实了其染色体数目为28条。

实验中观察到了‘云粉’花粉母细胞减数分裂至花粉粒形成的全过程(图5-A～K)。 前期I(图5-B) 比较复杂，在其中可观察到三价体、二价体、单价体(图5-L)。中期I(图3-D)各成对的同源染色体双双移向细胞中央的赤道板，着丝点成对排列在赤道板两侧，细胞质中形成纺锤体。后期I(图5-E)由纺锤丝的牵引，使成对的同源染色体各自发生分离，并分别移向两极，在其中可以观察到染色体桥(图5-M)。减数第二次分裂染色体不再复制，每条染色体的着丝点分裂，姐妹染色单体分开，分别移向细胞的两极(图5:L)，有时还伴随细胞的变形。减数第二次分裂实际上是一次普通的有丝分裂。在中期Ⅱ中观察到八字纺缍体(图5-G)，减数分裂Ⅱ完成后除形成四分体外(图5-N)还观察到三分体(图5-O)和二分体(图3-P)。

表1 ‘云粉’花粉母细胞减数分裂进程与花蕾大小、花萼形态和花药色泽的相关性Table 1 Correlation between meiotic process and bud size,calyx morphology,anther colour of Rosa ‘Yunfen’

A:花粉母细胞(左)与药壁细胞(右)；B：减数分裂后期Ⅱ时的染色体(n=x=14)A: Pollen mother cells (left) and anther wall cells (right); B: Chromosomes in anataphaseⅡ(n=x=14)图4 ‘云粉’的花粉母细胞及减数分裂后期Ⅱ时的染色体Fig.4 Pollen mother cells of Rosa‘Yunfen’and chromosomes in its anataphaseⅡ

A: 间期Ⅰ；B: 前期Ⅰ；C: 中期Ⅰ；D: 后Ⅰ；E: 末期Ⅰ； F: 间期Ⅱ；G: 中期Ⅱ；H: 后期Ⅱ；I: 末期Ⅱ；J: 即将释放的花粉；K: 成熟花粉；L：后期Ⅰ中观察到的异常分裂现象(左：三价体，右：单价体)；M: 减数分裂的非同步性；N: 四分体；O: 三分体；P: 二分体A: IntervalⅠ; B: ProphaseⅠ; C: Metaphase Ⅰ; D: AnaphaseⅠ; E: TelophaseⅠ; F: Interval Ⅱ; G: MetaphaseⅡ; H: AnaphaseⅡ; I: TelophaseⅡ; J: Pollens which will be released; K: Mature pollens; L: Abnomalities in the anaphase Ⅰ(left arrow: Trivalent; Right arrow: Univalent); M: Non-synchronism of PMCs meiosis division; N: Tetrad; O: Triad; P: Dyad图5 ‘云粉’花粉母细胞减数分裂过程 Fig.5 Meiosis process of R.‘Yunfen’ pollen mother cells

2.4 ‘云粉’花粉母细胞减数分裂的不同步性

‘云粉’从枝条顶端开始现蕾发育，即使同一植株不同枝条的花蕾发育程度也不同。在同一花蕾中，外轮花药分裂比内轮花药快。同一个花药中的花粉母细胞减数分裂速度也不完全一致(图5-M)，同一视野里可以观察到分别处于分裂后期I(a)和分裂末期I(b)的细胞。

3 讨 论

3.1 花粉母细胞的识别

由于压片时是将整个花药都压上去，所以在镜检时最重要的是分清楚花粉母细胞和药壁细胞以及其他组织细胞。只有正确地找到了花粉母细胞才能观察减数分裂的进程。花粉母细胞和药壁细胞的主要区别有：花粉母细胞较大，一般是药壁细胞的2倍以上(图4-A，左)。花粉母细胞第一次分裂后产生的2个子细胞即二分子，各呈半球形；第二次分裂后产生的4个子细胞即四分子，各呈1/4球形，这些特征是药壁细胞分裂过程中所没有的。在减数分裂过程中，花粉母细胞的大小一般变化不大，因此可根据第二次分裂期细胞的大小确认第一次分裂期的花粉母细胞。花粉母细胞外围较圆，基本看不到细胞壁，而药壁细胞常呈多边形，细胞壁清晰可见[17]，但是并不是所有花粉母细胞都是较圆，早期的花粉母细胞也有其他形状的，如：方形、多边形以及一些不规则的形状。因此在观察时不能只看其中的某一方面就错认为是花粉母细胞，而要几个方面全部结合起来综合观察，才能确认是不是花粉母细胞。另外，花粉母细胞染色比其他的细胞较深，且是整个细胞都被染上颜色。其他组织的细胞只是细胞的壁以及细胞核染上颜色，细胞内不染色或只染上很浅的颜色。

3.2 ‘云粉’花粉母细胞减数分裂异常与育性的关系

在‘云粉’PMCs减数分裂后期Ⅱ中观察到八字形纺锤体(图5-G)，致使一部分PMCs形成三分体。在‘云粉’PMCs减数分裂过程中除三分体外还观察到二分体，它们都将产生2n配子。这首先降低了n花粉的数量，其次所形成的2n配子如果在与不能形成2n雌配子或亲和性较低的品种杂交时，将降低结实率和结籽率。当其作为父本时，它的n配子与产生n配子的母本(2n=4x=28)杂交将产生4倍体杂交后代，它的2n配子与此母本杂交将几乎不结实。由于蔷薇属植物自然产生 2n 配子的比例不超过3.5 %[12]，因此，‘云粉’产生2n配子，虽然将在一定程度上降低了其作父本时的结籽率，但可能不是‘云粉’做父本时结实率差异较大、单花结籽数低的主要原因。在‘云粉’PMCs减数分裂Ⅰ中观察到三价体、二价体、单价体，由于同源四倍体产生三价体的几率极低[7]，由此推测‘云粉’可能不是同源四倍体，那么亲本之间染色体组的差异就可能是造成其作‘父本’时结实率差异较大的原因。但相同组合的反交实验表明，以‘云粉’作母本时的结实率很高(73.5 %～94.3 %)、相应的单花结籽数也高(13.65～21.46粒)[30]，这说明亲本之间的染色体组差异不大，不会导致其作‘父本’时结实率差异较大。张颢等的研究表明，月季花粉的萌发率是影响月季杂交结实率的关键因素[5]，而‘云粉’的花粉活力中等(离体萌发率：33.34 %± 1.70 %，活体萌发率：31.56 %± 1.63 %)[31]，当其作为父本与亲和性较低的品种杂交时，会在一定程度上降低结实率、尤其是结籽率，但也不会致使其结实率和结籽数为0。因此，‘云粉’因花粉母细胞减数分裂过程存在异常分裂现象，从而产生2n配子，会在一定程度上影响其在杂交育种中做父本时的结实率。要研究‘云粉’作父本时结实率差异较大的主要原因还需结合其它方面的研究，如确定异常分裂的花粉母细胞的比例、2n花粉数量及其萌发率，花粉与不同品种之间的亲和性，等。虽然‘云粉’作为父本存在一定的局限性，但其作为母本的优势明显[30]，是作为切花月季杂交育种的优异种质资源。

4 结 论

‘云粉’是中国国内首个通过杂交选育并获授权的切花月季新品种。研究表明当其花蕾横径为1.03～1.07 cm、纵径为2.9～3.4 cm大小、花药由淡绿色转变为淡黄色时最适合进行花粉母细胞减数分裂观察。‘云粉’花粉母细胞的减数分裂存在不同步性，在减数第一次分裂过程中还存在单价体、三价体、染色体桥等异常现象，减数第二次分裂末期存在三分体和二分体，最终产生2n雄配子，从而在一定程度上降低了它在月季杂交育种中作父本时的结籽率。

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ObservationonPollenMotherCellMeiosisofNewRoseCultivar,Rosa‘Yunfen’

CHEN Min1， WANG Yuan-yuan2,LI Xia1,LI Hui-min1,WU Min1,ZHANG Hao1,WANG Qi-gang1,ZHANG Ting1,JIAN Hong-ying1*

(1.Flower Research Institute,Yunnan Academy of Agricultural Sciences/Yunnan Key Laboratory for Flower Breeding/National Engineering Research Center for Ornamental Horticulture，Yunnan Kunming 650200，China；2.College of Arts and Sciences,Yunnan Normal University，Yunnan Kunming 650222，China)

【Objective】Rosa‘Yunfen’ was a plant breeders’ right owned new cut rose cultivar.The rose hip and achene setting rates were very low and differred significantly among crossing combinations whenR.‘Yunfen’ was used as the paternal parents in hybridization breeding.【Method】To find the reason,pollen mother cell meiosis ofR.‘Yunfen’ was observed and the meiotic phases in different periods of the division were recorded in this study.【Result】The optimal time for observation of meiosis was when the bud was about 1.03-1.07 cm wide and 2.9-3.4 cm long.At that stage,the anther colour turned from light green to yellowish green.The meiotic behaviors of pollen mother cells were non-synchronic and several meiosis phases could be observed in the same anther.Abnormal phenomina of meiosis such as univalent,trivalent and chromosome-bridge could be observed in the first division of meiosis.Then,triad and dyad were produced in the second division of meiosis ofR.‘Yunfen’,by which 2n pollens were formed.【Conclusion】The abnormal division of PMCs ofR.‘Yunfen’ might be a reason for the low hip and achene setting rate when used as paternal parent in breeding.

RosahybridL.； Pollen mother cell (PMC)； Meiosis； 2n pollen； Hip and achene setting rate

1001-4829(2017)4-0881-06

10.16213/j.cnki.scjas.2017.4.028

2015-05-08

国家自然科学基金地区基金项目(31060267,31560301)

陈 敏(1974-)，男，实验师，现从事花卉育种研究，E-mail: 215652969@qq.com，*为通讯作者,蹇洪英，E-mail: ynwildflower@aliyun.com。

S685.12

A

(责任编辑 王家银)