长链非编码RNAMALAT1在冠状动脉粥样硬化性心脏病患者外周血清中的表达及临床意义

陆 强，赵建荣

（上海瑞金医院卢湾分院心内科，上海200020）

·论 著·

长链非编码RNAMALAT1在冠状动脉粥样硬化性心脏病患者外周血清中的表达及临床意义

陆 强，赵建荣

（上海瑞金医院卢湾分院心内科，上海200020）

目的 探讨长链非编码RNA（long non-coding RNAs，lncRNAs）MALAT1在冠状动脉粥样硬化性心脏病（冠心病）患者外周血清中的表达水平及其临床意义。方法 采用实时定量聚合酶链反应检测122例冠心病患者（冠心病组）和48例冠状动脉造影检查阴性人群（对照组）血清lncRNA MALAT1表达水平；将冠心病组患者分为未接受他汀类药物治疗亚组和接受他汀类药物治疗亚组，分析冠心病患者血清lncRNA MALAT1表达水平差异。采用单因素及多因素分析影响冠心病患者临床预后的危险因素。结果 与对照组相比，冠心病组血清lncRNA MALAT1的表达水平明显升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）；冠心病未接受他汀类药物治疗亚组血清lncRNA MALAT1表达水平高于接受他汀类药物治疗亚组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。此外，单因素分析发现患者的年龄、吸烟、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）浓度、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）浓度、糖尿病、原发性高血压（高血压）及血清MALAT1的表达是冠心病的危险因素（P＜0.05）；进一步多因素分析发现高血压、低密度脂蛋白胆固醇浓度及血清MALAT1表达水平是冠心病的独立危险因素（P＜0.05）。结论 冠心病患者外周血清中lncRNA MALAT1表达水平升高；他汀类药物可降低冠心病患者血清lncRNA MALAT1表达水平。lncRNA MALAT1可能是潜在的冠心病预后预测的血清标志物。

冠状动脉疾病；长链非编码RNA MALAT1；临床意义

冠状动脉粥样硬化性心脏病（冠心病）是最常见的心血管系统疾病之一，已成为现代社会影响人类健康的最大杀手之一。其中动脉血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）增殖和血管内膜的新生是动脉粥样硬化发生、发展中的重要生物学过程［1-2］。长链非编码RNA（long non-coding RNAs，lncRNAs）是一类长度超过200 nt的非编码RNA，近年来亦被证明是非编码RNA中可发挥生物学功能的重要组分［3-4］。LncRNA主要在表观修饰、转录及转录后这3种层面上调控基因的表达。众多研究结果提示，在肿瘤的发生、发展过程中，lncRNAs均有参与并发挥着重要作用［5-6］，然而，LncRNAs在心血管系统疾病中的作用却依然不十分清楚。MALAT1（metastasis associated in lung adeno⁃carcinoma transcript）又称为非编码核内富含转录物2（noncoding nuclear-enriched abundant transcript 2，NEAT2），是一种主要在核内表达且高度保守的，长度为7 kb的折叠非编码RNA。研究表明MALAT1在哺乳动物体内多种组织细胞内表达，因此，近年得到广泛研究［7］。MALAT1最初发现在肿瘤组织样本中过度表达，并参与调控肿瘤细胞的增殖、侵袭、迁移及代谢。MALAT1调控代谢相关基因的表达，在细胞G1/S及有丝分裂过程中发挥关键作用［8］。随着lncRNA与血管疾病的研究不断深入，Michalik等［9］发现MALAT1参与调控血管内皮细胞的生物功能。MALAT1的沉默表达能显著抑制细胞的增殖从而减少新生血管的生成。本研究旨在探讨MALAT1在冠心病患者外周血清中的表达水平及其临床意义，为冠心病的防治提供新的思路。

1 资料和方法

1.1 一般资料

选取2014年1月至2016年6月期间相继在上海瑞金医院卢湾分院心内科就诊的患者，包括122例冠心病阳性病例和48例冠心病阴性对照。冠心病组：冠心病定义为冠状动脉造影时左主干、前降支、回旋支、右冠状动脉或其分支的血管直径狭窄超过50%；其中男85例，女37例；年龄60（36～89）岁。对照组：冠状动脉造影结果阴性对照组均行冠状动脉造影明确排除冠心病；其中男24例，女24例，年龄59（33～87）岁。122例冠心病患者中，从未接受他汀类药物治疗的有77例（未接受他汀类药物治疗亚组）；服用阿托伐他汀片（辉瑞）20 mg/d连续6～12个月的有45例（接受他汀类药物治疗亚组）。所有患者间无血缘关系。采集入选对象外周血液样本同时收集其临床资料，包括性别、年龄、是否患有原发性高血压（高血压）、是否患有高血脂、是否患有糖尿病、是否发生过心肌梗死。记录所有研究对象完整病史信息。所有入选患者确诊后即刻用含抗凝剂的紫色采血管采集静脉血静置于4℃冷藏30 min后，室温下3 000 r/min离心15 min，留取上层血清，置于-80℃冰箱备用。所有患者均签署知情同意书，经我院伦理委员会批准。

1.2 血清总RNA提取

将分离所得血清，置于冰上融化；取250 μL血清样品，加入 750 μLTrizol，振荡器混匀，静置5 min；加入 200 μL氯仿，振荡器混匀，静置10 min；室温下12 000 r/min离心10 min，留取上清液并量取其体积，转移至另一个无Rnase的EP管中；分别加入与上清液等体积的异丙醇，振荡器振荡混匀，室温下静置3 min；室温下12 000 r/min离心10 min；倒出管内液体，加用1 mL75%乙醇；室温12 000 r/min离心2 min；倒出乙醇，并用Tip枪头将剩余液体吸干净，晾干。每管中加入10 μL无Rnase的双蒸水，以能够充分溶解RNA；用分光光度计测定总RNA浓度及纯度。

1.3 实时定量聚合酶链反应分析lncRNAMALAT 1的表达水平

提取血清总RNA，逆转录反应参照AMV逆转录试剂盒说明，在20 μL体系中加2 μg总RNA进行cDNA的合成。实时定量聚合酶链反应（quanti⁃tative real time polymerase chain reaction，QRTPCR）采用2xSYBR Green PCR Master Mix，取适量cDNA作为摸板，引物浓度 0.4 μmol/L，15 μL体系进行扩增，每个待测样本设置3个平行样，根据目标基因设计合成相应上下游引物进行PCR扩增，以GAPDH作为内参照。3次独立实验后得到的数据运用公式RQ=2-ΔΔCt的方法进行分析。

1.4 统计学分析

采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析。血液标本中LNCRNA MALAT1的表达用（±s）表示，采用t检验分析。单因素及多因素回归分析冠心病的危险因素。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 两组基本临床资料及实验室指标比较

122例冠心病患者和48例阴性对照者的基线资料及实验室指标比较，详见表1和表2。冠心病组和对照组年龄、吸烟史、糖尿病史、糖化血红蛋白（glycosylated hemoglobin A1c，HbA1c）、三酰甘油（triglyceride，TG）、总胆固醇（total cholesterol，TC）、低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoproteincholesterol，LDL-C）、高敏C反应蛋白（high-sensi⁃tive C-reactive protein，hs-CRP）、收缩压、脂蛋白（a）［lipoprotein a，Lp（a）］比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；而两组性别、高血压史、高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoprotein-cholesterol，HDL-C）比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。冠心病组中男性明显多于女性，高血压患病率高，HDL-C浓度低于对照组。

表1 两组基本临床资料及实验室指标（计量资料）比较［±s］

表1 两组基本临床资料及实验室指标（计量资料）比较［±s］

临床特征n年龄（岁）HbA1c（%）TG（mmol/L）TC（mmol/L）LDL-C（mmol/L）HDL-C（mmol/L）hs-CRP（mg/L）Lp（a）（mg/L）冠心病组122 60.0±10.9 7.03±0.49 1.85±1.20 4.47±0.81 2.39±0.55 1.18±0.33 4.88±0.23 292.1±105.6对照组48 63.5±10.1 5.27±0.82 1.52±0.50 4.35±0.54 2.24±0.37 1.65±0.24 3.75±0.43 228.7±112.4 P值0.290 0.173 0.152 0.592 0.270 0.019 0.270 0.170

表2 两组基本临床资料及实验室指标（计数资料）比较［n（%）］

2.2 两组血清中lncRNA MALAT 1的表达水平比较

QRT-PCR检测结果提示，与对照组比较，冠心病组血清MALAT1表达水平显著升高，差异有统计学意义（t=10.23，P＜0.001），见图1。

2.3 两冠心病亚组血清MALAT 1表达水平比较

接受他汀类药物治疗亚组血清lncRNA MALAT1表达水平比未接受他汀类治疗亚组明显降低，差异有统计学意义（P＜0.0 5），见图2。接受他汀治疗亚组lncRNA MALAT1表达水平与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

图1 两组血清MALAT1的表达水平比较图

图2 3组血清lncRNA MALAT1表达水平比较图

2.4 单因素及多因素回归分析冠心病的危险因素

单因素非条件Logistic回归分析结果发现年龄、吸烟、LDL-C、HDL-C、糖尿病、高血压及血清MALAT1的表达是冠心病的危险因素，详见表3。进一步多因素分析发现高血压、LDL-C及血清MALAT1表达是冠心病的独立危险因素，详见表4。

3 讨论

动脉粥样硬化是动脉病理改变中最常见、最严重的一种，常导致心、脑等重要器官受累，严重影响人们的健康［10-11］。血管内皮损伤是动脉粥样硬化发生、发展的始动因素。如果能够早期干预内皮损伤，就能大大减少冠心病的致残率及病死率，所以对调控血管内皮细胞损伤修复相关基因的研究日益受到重视［12-13］。

表3 冠心病的危险因素单因素回归分析结果

表4 冠心病的危险因素多因素回归分析结果

众所周知，人类基因组中的可转录本超过90%，但是其中只有大约2%为蛋白编码基因。这意味着非编码RNA是哺乳动物转录组中的重要组成部分，在这些非编码RNA中，长度为21～23 nt的微小RNA（microRNA，miRNA）已被证明在多种生物及病理学过程中发挥着重要作用。lncRNA及其亚型基因lncRNA（long intergenic non-coding RNAs，lincRNAs）这一类长度超过200 nt的非编码RNA，近年来亦被证明是非编码RNA中可发挥生物学功能的重要组分。众多研究结果提示，在肿瘤的发生、发展过程中，lncRNAs均有参与并发挥着重要作用，然而，lncRNAs在心血管系统疾病中的作用却依然不十分清楚。近期的一项研究鉴定出了一个名为Braveheart（Bvht）的lncRNA，该lncRNA与心肌细胞的维持和命运高度相关［14］。过去的一项报道又揭示了一个位于人染色体9p21.3上的lncRNA-ANRIL（CDKN2B-AS），与冠心病的患病风险性高度相关［15-16］。尽管如此，lncRNA在心血管系统疾病尤其是动脉粥样硬化中的作用和分子机制仍不十分明确。前期通过基因芯片发现LncRNA MALAT1在冠心病患者血清中明显高于正常对照组，提示LncRNA MALAT1可能参与调节冠心病的发生、发展。

MALAT-1基因位于染色体11q13上，转录物是lncRNA，长度大于8 000 nt，广泛存在于人类和小鼠正常组织的细胞核内。MALAT-1表达序列在进化上的高度保守性提示其可能具有某些潜在的重要功能。MALAT-1在多种肿瘤中表达，与患者的预后相关［17］。然而，关于MALAT-1在冠心病患者中的具体作用，目前尚无相关报道。

本研究采用QRT-PCR检测122例冠心病患者和48例冠状动脉阴性对照组血清lncRNA MALAT1表达水平；分析冠心病血清lncRNA MALAT1表达水平与冠状动脉狭窄程度的关系；分析冠心病未接受他汀类药物治疗亚组和接受他汀类药物治疗亚组患者血清lncRNA MALAT1表达水平差异。本研究结果发现与对照组相比，冠心病患者血清lncRNA MALAT1的表达水平明显升高；未接受他汀类药物治疗亚组血清lncRNA MALAT1表达水平高于接受他汀类药物治疗亚组；单因素分析发现患者的年龄、吸烟、LDL-C、HDL-C、糖尿病、高血压及血清lncRNA MALAT1的表达是冠心病的危险因素；进一步多因素分析发现高血压、LDL-C及血清lncRNA MALAT1表达是冠心病的独立危险因素。

以上研究结果提示冠心病患者外周血清中lncRNA MALAT1表达水平升高；他汀类药物可降低冠心病患者血清lncRNA MALAT1表达水平。lncRNA MALAT1可能是潜在的诊断和预测冠心病预后的血清标志物。

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Expression and significance of serum long non-coding RNAs MALAT1 in patients with coronary athero⁃sclerotic heart disease

LU Qiang，ZHAO Jian-rong
（Department of Cardiology，Shanghai Ruijin Hospital Luwan Branch Hospital，Shanghai 200020，China）

ObjectivesTo investigate the expression and clinical significance of long non-coding RNAs（lncRNAs）MALAT1 in patients with coronary atherosclerotic heart disease（CAD）.MethodsSerum lncRNA MALAT1 expres⁃sion levels were measured in 122 patients with CAD（CAD group）and 48 cases with negative coronary angiography re⁃sults（control group）by quantitative real time polymerase chain reaction（QRT-PCR）.Patients in CAD group were further divided into receiving statin therapy subgroup and not receiving statin therapy subgroup.Serum lncRNA MALAT1 expression levels were compared between the two subgroups.Risk factors for clinical outcomes of patients with CAD were analyzed by univariate factor and multiple factor analysis.ResultsCompared with control group，serum ln⁃cRNA MALAT1 expression levels were significantly increased in CAD group（P＜0.05）.Serum lncRNA MALAT1 ex⁃pression levels in not receiving statin therapy subgroup was significantly higher than that in receiving statin therapy sub⁃group（P＜0.05）.In addition，univariate analysis found that the patient's age，smoking，low density lipoprotein choles⁃terol（LDL-C）concentration，high density lipoprotein cholesterol（HDL-C）concentration，diabetes，hypertension and serum lncRNA MALAT1expression level were risk factors for CAD（P＜0.0 5）；further multivariate analysis found that hypertension，LDL-C concentration and serum lncRNA MALAT1 expression level were independent risk factors for CAD（P ＜0.05）.ConclusionsSerum lncRNA MALAT1 expression level in patients with CAD significantly de⁃crease，which may be as a potential marker for diagnosis and prognosis of CAD.

coronary atherosclerotic heart disease；long non coding RNA MALAT1；clinical significance

R541.4

A

1007-9688（2017）05-0506-05

10.3969/j.issn.1007-9688.2017.05.02

陆强（1980-），男，主治医师，研究方向为冠心病的诊治。

2016-12-12）