刺老苞根皮含药血清对原代成骨细胞增殖、分化和矿化功能的影响❋

依香叫，王松月，李金诚，燕梦云，裴凌鹏

(中央民族大学，北京 100081)

【方药研究】

刺老苞根皮含药血清对原代成骨细胞增殖、分化和矿化功能的影响❋

依香叫，王松月，李金诚，燕梦云，裴凌鹏△

(中央民族大学，北京 100081)

目的：研究不同浓度刺老苞根皮含药血清对原代成骨细胞的增殖、分化及矿化功能的影响。方法：SPF级健康雌性SD 大鼠(80 只)给予蒸馏水、刺老苞根皮水煎剂高、中、低3种剂量浓度，连续灌胃7 d制备含药血清。各组含药血清干预培养成骨细胞，采用微量酶标法检测碱性磷酸酶活性、茜素红染色钙化结节并计数，流式PI单染法检测成骨细胞周期。结果：在干预培养后与模型对照组比较，各剂量组碱性磷酸酶活性、钙化结节数有所升高，中、高剂量组高于模型对照组；与模型对照组比较，流式细胞仪检测发现各剂量组G0/G1期、G2/M期明显下降，S期和G2/M+S期明显升高。结论：刺老苞根皮含药血清可通过延长原代成骨细胞S期，促进其增殖、分化及矿化功能的作用。

刺老苞根皮；原代成骨细胞；碱性磷酸酶；矿化结节；成骨细胞周期

土家族药刺老苞根皮为五加科楤木属植物楤木(Aralia echinocaulis Hand.Mazz)及其变种白背叶楤木(Aralia chinensis L. var.nuda Nakai)的根皮或茎皮，药材片状或槽状，气微香，嚼之带黏液性，味辛性平，归肝肾经，功能滋阴补肾、祛风湿、壮筋骨、散瘀血、消肿毒，可用于风湿痹痛、跌打损伤、骨折等治疗[1-3]。经大量体内实验及临床数据证明，刺老苞根皮能促进骨折愈合[5-9]。现通过刺老苞根皮含药血清干预原代成骨细胞来观察其对成骨细胞增殖、分化及功能的影响，以进一步研究其作用机制。

1 材料

1.1 实验动物

新生24 h SD大鼠乳鼠10只。SPF级健康雌性SD 大鼠80 只，3 月龄，体质量(270±20) g，中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供(许可证号SCXK-(军)2012-0004)。

1.2 药物

刺老苞根皮采于湖北恩施地区(经北京中医药大学生药系杨瑶珺教授鉴定，批号0P1101)，湖北恩施中药材有限公司。

1.3 主要试剂

α-MEM培养基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶溶液(美国Gibco)，青霉素/链霉素、茜素红、II 型胶原酶、β-甘油磷酸钠、抗坏血酸(美国Sigma)，PBS 磷酸盐缓冲液(粉剂，北京昌盛生物技术有限责任公司)，碱性磷酸酶试剂盒(微量酶标法，南京建成科技公司)，PI/RNase Staining Buffer(美国BD Pharmingen公司)。

1.4 主要仪器

细胞超净操作台(苏州苏洁净化设备有限公司)，CO2培养箱(美国Thermo Scientific)，电脑型倒置显微镜(日本OLYMPUS)，流式细胞仪(美国BD公司)。

2 方法

2.1 刺老苞根皮含药血清制备与分组

2.1.1 刺老苞根皮含药血清制备 SPF级健康雌性SD大鼠80 只适应性喂养1周后，通过在胫骨上打孔模拟骨折二期愈合的理想力学环境。术后第2天用SPSS软件按随机数字表法分为模型组、刺老苞根皮低剂量组、刺老苞根皮中剂量组、刺老苞根皮高剂量组4组各20只。用药剂量根据人体习用安全剂量(20 g·70 kg-1)，按人/鼠表面积比率换算等效计量法计算。刺老苞根皮灌胃剂量为1.8 g·kg-1·d-1，以临床剂量为中剂量，1/2、2倍剂量为低、高剂量(即分别为0.9 g·kg-1·d-1、3.6 g·kg-1·d-1)。模型组给予等剂量等频率蒸馏水，术后7 d取材(取材前进食12 h)，末次给药后1 h称重，3%戊巴比妥钠(3 mg·kg-1)腹腔注射麻醉，在无菌操作下腹主动脉采血，将采集来的血样在室温下静置2 h后，1800 r·min-1离心20 min，分离出血清，56 ℃水浴灭活30 min，在0.22 μm微孔膜过滤除菌后分装，保存于-20 ℃备用。

2.1.2 分组 实验共分为4组：模型对照组(20% 模型对照组大鼠血清+α-MEM+10 mmol·L-1β-甘油磷酸钠+50 μg·mL-1抗坏血酸)、低剂量组(20% 刺老苞低剂量含药血清+α-MEM+10 mmol·L-1β-甘油磷酸钠+50 μg·mL-1抗坏血酸)、中剂量组(20% 刺老苞中剂量含药血清+α-MEM+10 mmol·L-1β-甘油磷酸钠+50 μg·mL-1抗坏血酸)、高剂量组(20% 刺老苞高剂量含药血清+α-MEM+10 mmol·L-1β-甘油磷酸钠+50 μg·mL-1抗坏血酸)。

2.2 原代成骨细胞培养及鉴定

取新生24 h内的SD大鼠乳鼠10只，放入75%乙醇浸洗乳鼠，将乳鼠转移到一个有盖培养皿内，在无菌操作下分离颅骨，清除颅骨表面的结缔组织，用PBS简单冲洗颅盖骨后放入15 mL离心管内，加入3 mL 0.25%胰蛋白酶液-II型胶原酶溶液(1∶2)(消化液)，37 ℃恒温水浴振荡消化5 min弃上清液。加入3 mL消化液，37 ℃恒温水浴振荡消化10 min，收集上清液并重复消化4次。将收集的消化液1500 r·min-1离心4 min弃上清液，重悬细胞，调整细胞密度后接种于25 cm2培养瓶。培养24 h后，换成骨细胞分化培养基(10% FBS+10 mmol·L-1β-甘油磷酸钠+50 μg·mL-1抗坏血酸)，每3 d换液1次，待细胞融合50%～70%后消化并传代，取3～6代细胞进行试验，经ALP(alkaline phosphatase碱性磷酸酶)染色和茜素红染色鉴定成骨细胞。

2.3 微量酶标法碱性磷酸酶活性实验

收集第3代原代成骨细胞，以1×105个·mL-1接种于24孔板，每孔1 mL，每组设3个复孔，每2 d换液1次，并每天观察细胞状态。培养48 h后按实验分组更换不同含药血清培养基。分别于0 h、24 h、48 h、72 h、96 h用微量酶标法检测ALP活性(参照碱性磷酸酶微量酶标法说明书操作)。

2.4 茜素红染色法检测细胞矿化功能实验

收集第3代原代成骨细胞，以1×105个·mL-1接种于24孔板，每孔1 mL，每组设3个复孔，每2 d换液1次，并每天观察细胞状态。培养48 h后按实验分组更换不同含药血清培养基，10 d后取出24孔板，用PBS冲洗3遍，每孔加入2 mL 4%多聚甲醛固定15 min，蒸馏水冲洗3遍，每孔加入2 mL茜素红染液，放置于37 ℃、45 min后蒸馏水冲洗3遍，用荧光倒置显微镜拍照并计数钙化结节数量。

2.5 流式PI单染法检测细胞周期实验

收集第3代原代成骨细胞，以1×105个·mL-1接种于6孔板，每孔2 mL，每组设3个复孔，每天观察细胞状态。培养48 h后按实验分组更换不同含药血清培养基，干预培养48 h后，0.25%胰蛋白酶消化并收集细胞，用预冷PBS(1×)冲洗2遍后，边振荡边加预冷70%乙醇，存放于4 ℃、24 h后加入PI/RNase Staining Buffer染液0.5 mL，室温下孵育15 min，上流式细胞仪检测并分析结果。

2.6 统计学方法

3 结果

3.1 原代成骨细胞的鉴定结果

图1显示，原代成骨细胞用成骨细胞完全培养基(含10% 胎牛血清)在37 ℃、5% CO2恒温培养箱中培养。经倒置显微镜观察，细胞在24 h后开始贴壁，48 h后完全贴壁，细胞为单核，呈长梭形和多角形等形态，10 d左右细胞融合成铺路石样，并伴有矿化结节的出现。

3.2 碱性磷酸酶活性检测结果

表1显示，不同浓度刺老苞根皮含药血清在0～96 h期间干预成骨细胞并用微量酶标法检测ALP活力。结果显示，与模型对照组比较，48 h、72 h中剂量组ALP活力高于模型对照组(P<0.05)，96 h中剂量组ALP活性明显升高(P<0.01)，48～96 h高剂量组ALP活性明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)。

图1 原代成骨细胞培养及鉴定

组别例数ALP(金氏单位/100ml)0h24h48h72h96h对照组30.095±0.0060.102±0.0100.169±0.0120.201±0.01500.231±0.014低剂量组30.095±0.0060.109±0.0140.198±0.0150.235±0.01700.269±0.020中剂量组30.095±0.0060.121±0.0170.279±0.017*0.328±0.0180*0.391±0.020**高剂量组30.095±0.0060.124±0.0160.339±0.017**0.398±0.1020**0.433±0.023**

注：与模型对照组比较：*P<0.05，**P<0.01

3.3 成骨细胞矿化功能检测结果

表2显示，不同浓度含药血清对成骨细胞作用10 d后，经茜素红染色后计数钙化结节的个数。结果显示，与模型对照组比较，低剂量组钙化结节数增多且差异有统计学意义(P<0.05)，中剂量组和高剂量组的矿化结节数明显增多且差异有统计学意义(P<0.01)。

表2 不同浓度含药血清对成骨细胞矿化的影响

注：与对照组比较：*P<0.05，**P<0.01

表3 不同浓度含药血清对成骨细胞周期的影响

注：与对照组比较：*P<0.05,**P<0.01

3.4 成骨细胞周期检测结果

表3显示，经过流式细胞仪检测发现，成骨细胞的细胞周期G0/G1期与模型对照组比较，各剂量组都有不同程度的降低，其中中剂量组、高剂量组降低，差异有统计学意义(P<0.01)；成骨细胞的细胞周期G2/M期与模型对照组比较，各剂量组均有所降低，其中中剂量组、高剂量组降低，差异有统计学意义(P<0.05)；成骨细胞的细胞周期S期与模型对照组比较，各剂量组均有所升高，差异有统计学意义(P<0.01)；成骨细胞的细胞轴系G2/M+S期与模型对照组比较，各剂量组明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)。

4 讨论

土家族是我国的主要少数民族之一，主要分布于我国黔、湘、渝、鄂相邻的武陵山、大娄山、大巴山、巫山余脉，这些地区地势险峻陡峭、崎岖不平，给土家族人民的生产生活带来极大的不便，加之以前战事频繁，常有毒蛇出没，造成金创、骨折外伤出现较多，使土家医在骨伤科疾病的治疗用药方面积累了大量的宝贵经验。土家医经长期的医疗实践，形成了土家族传统医学理论体系，其医学理论基础是“三元”学说，认为骨折后如经脉畅通，气、血、精充分滋养，头元、腹元、足元调和方能愈合[2]。现代医学认为，骨折愈合的基础是骨膜成骨细胞再生，成骨细胞与破骨细胞的动态平衡过程[4]，故成骨细胞在骨折愈合中起重要作用。成骨细胞是一种典型的分泌细胞，其胞浆膜上富含碱性磷酸酶。碱性磷酸酶可调节骨基质成熟稳定，是成骨细胞分化的早期指标。经前期研究民族药刺老苞根皮对骨折愈合的作用机制发现，刺老苞根皮含有较高的总黄酮、总皂苷、多糖和丰富的微量元素，能够提高大鼠骨组织内 Ca、 Mg、 P、 Mn、 Cu、 Se、 Zn 等矿物元素的含量，升高骨碱性磷酸酶转移酶(ALP)、骨钙素、羟脯氨基酸、骨磷含量，改善胫骨骨折大鼠骨代谢情况，有效促进骨折愈合修复[5-9]。

本实验进一步采用混合酶消化法多次消化乳鼠颅盖骨获得成骨细胞的方法培养获得成骨细胞，同时利用ALP染色和钙茜素红染色鉴定成骨细胞，并取3～6代成骨细胞为研究对象。从实验结果可知，刺老苞根皮含药血清通过延迟S期(DNA的合成期)促进成骨细胞增殖，诱导成骨细胞的分化，增强其矿化的能力，从而促进骨折愈合。但刺老苞根皮含药血清调节成骨细胞增殖、分化的作用机制尚未明确，仍需进一步探究。

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EffectofAraliaEchinocauiisHand.MazzContainingSerumonProliferation,Differentiation,MineralizationofPrimaryOsteoblasts

YI Xiang-jiao, WANG Song-yue, LI Jin-cheng, YAN Meng-yun, PEI Ling-peng△

(MinzuUniversityofChina,Beijing100081,China)

Objectives:Observing the influence of Aralia echinocauIis Hand.Mazz containing serum on the proliferation, differentiation, mineralization of primary osteoblasts. Methods: SD rats (n=80) were used to make Aralia echinocauIis Hand.Mazz containing serum by gastric perfusion for seven days with distilled water, Aralia echinocauIis Hand.Mazz water decoction high, middle, low dosages. In vitro, the primary osteoblasts were cultured with the drug serum in each group. Detection of alkaline phosphatase activity by trace enzyme method, cells were detected by alizarin red staining experiments, osteoblasts cycle were analyzed by flow cytometry. Results: After osteoblasts were intervened with the serum in each group, compared with model groups, osteoblasts were cultured with drug serum in each group, the alkaline phosphatase activity and the ability of mineralization were improved. The G0/ G1and G2/M phase of the osteoblasts cycle were decreased. The S and G2/M+S phase were increased. Conclusion: Effects of Aralia echinocaulis Hand.Mazz containing serum could extend the S phase of osteoblasts. The proliferation, differentiation, mineralization of primary osteoblasts were promoted.

Aralia echinocauIis Hand. Mazz; Primary osteoblast; Alkaline phosphatase; Mineralization; Osteoblasts cycle

R285.5

B

1006-3250(2017)09-1305-03

国家自然科学基金资助项目(81673769)-基于信号网络耦联节点理论探讨刺老苞根皮有效成分群干预糖尿病骨质疏松症的分子机制研究;国家自然科学基金资助项目(81473451)-基于3D打印技术与分子信号网络理论研究刺老苞根皮有效成分群调控骨折愈合作用机制；国家自然科学基金资助项目(81270051)-基于Wnt/β-catenin与TGF-β/BMPs信号耦联网络的刺老苞根皮干预骨折愈合分子机制研究；教育部长江学者和创新团队发展计划资助项目(IRT-13R63)-中国少数民族传统医学

依香叫(1988-)，女(傣族)，云南人，在读博士，从事民族医药学研究。

裴凌鹏(1976-)，副研究员，硕士研究生导师，从事民族医药与临床学研究，E-mail: lppei@hotmail.com。

2017-04-05