电针对类风湿关节炎大鼠口服雷公藤甲素药动学及肝损指标的影响❋

肖 燕，张皓然，陈 昊，顾一煌，洪汉青

(南京中医药大学第二临床医学院，南京 210023)

【针灸研究】

电针对类风湿关节炎大鼠口服雷公藤甲素药动学及肝损指标的影响❋

肖 燕，张皓然，陈 昊，顾一煌△，洪汉青

(南京中医药大学第二临床医学院，南京 210023)

目的：为电针联合雷公藤甲素(triptolide，TPL)治疗类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)，同时减轻TPL所致的肝损提供增效减毒的实验依据。方法：RA模型采用弗氏完全佐剂(freund’s complete adjuvant，CFA)建立，运用液相色谱-质谱联用技术(liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS)检测大鼠血浆TPL浓度，试剂盒测定肝匀浆中谷氨酸-丙酮酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)含量及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)活性。结果：针药组大鼠足趾肿胀改善情况最好，药物组次之，再者为电针组；在同一时刻电针刺“足三里”后的血药浓度高于单独口服TPL的浓度，TPL的药动学参数：达峰时间(Tmax)提前，峰浓度(Cmax)及药时曲线下面积(area under the curve，AUC)提高；针药组ALT、AST含量及MDA活性均较药物组降低，SOD活性则升高。结论：电针“足三里”可以减轻RA大鼠足趾肿胀，提高TPL的血药浓度，进而提高其生物利用度，同时还可减轻TPL对RA大鼠肝组织的损伤，提高其抗氧化应激能力。

电针；类风湿关节炎；雷公藤甲素；药动学；液相色谱-质谱联用

类风湿关节炎(RA)是一种病因未明、慢性进行性、侵蚀性的全身性疾病，以关节和关节周围组织非化脓性炎症为主要表现，其早期治疗至关重要[1]。现代药理研究证实，TPL在抑制免疫炎症反应、抗肿瘤和抗生育等方面发挥着重要作用[2]，但TPL中毒剂量和有效剂量非常接近[3]，因此其应用受到极大限制。本研究旨在探讨电针对RA大鼠口服TPL的药动学及TPL致RA大鼠肝损伤的ALT、AST、MDA指标及抗氧化指标SOD的影响，为电针结合TPL治疗RA及同时减轻TPL所致的肝损提供增效减毒的实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物造模及分组 7周龄SPF级SD大鼠，雌雄各半，体质量(180±20) g共50只，购自上海斯莱特实验动物有限责任公司(动物许可证号2007000523799)，适应性喂养7 d。按照随机数字表法抽取10只作为空白对照，另40只根据相关文献[4]，取经消毒后的左侧后肢足垫皮内注射0.l ml CFA建造RA模型。按随机数字表法将RA大鼠分为模型组、电针组、药物组和针药组各10只，饲养室温为20～25 ℃，相对湿度控制在50%～60%。

1.1.2 主要试剂及仪器 CFA由Sigma公司提供(生产批号F5881)；YLS-7B足趾容积测量仪由河北邢台润联科技开发有限公司提供；泼尼松龙标准品、TPL标准品由上海惠诚生物科技有限公司提供；乙酸铵、甲酸、甲醇及乙酸乙酯由南京化学试剂有限公司提供；5810R冷冻离心机由德国Eppendorf生产，上海普林斯顿生物科技发展有限公司提供；SHIMADZΜ LC-20A高效液相色谱仪:LC-20AD泵2个、SIL-20AC自动进样器、CTO-20AC柱温箱、CBM-20A控制器由日本岛津液相色谱仪公司提供；4000 Q TRAP质谱仪由美国AB Sciex公司提供；AST、ALT测定试剂盒由世诺临床诊断制品上海贸易有限公司供给(生产批号J022、J027)；MDA、SOD测定试剂盒由南京建成生物工程研究所供给(生产批号20150915、20150918)。

图1 大鼠血浆中雷公藤甲素标准曲线

1.2 方法

1.2.1 足趾体积测量 采用足趾容积测量仪测量RA大鼠足趾体积。具体操作：自大鼠踝关节上画一标记线，以该线为标记，将大鼠足趾没入水中，水平面与该线平齐，测量足趾体积。每只大鼠每个足趾分别由2人各测量2次，取平均值记录数据，连续观察4周。

1.2.2 干预方法 用自制的鼠架俯卧位固定电针组大鼠，用0.25 mm×25 mm华佗牌毫针针刺双侧“足三里”(取穴参照《实验针灸学》[5])，进针直刺2～3 mm，平补平泻1 min，将电针仪的导线接到针柄上，给予连续波刺激(频率为1 Hz/s)，强度1～2 mA(以双下肢轻微抖动为度)，每天1次，每次20 min，电针干预结束后给予0.9%氯化钠水溶液(1.17×10-2mol/L)灌胃；药物组每天给予等量的TPL溶液(7.208×10-2mol/L)灌胃；针药组先给予与电针组相同的电针刺激，再给予同药物组等量的TPL溶液灌胃。于同一时间给予空白组、模型组以与其他组相同方式的抓取固定,并给予等量0.9%氯化钠水溶液灌胃，共干预14 d。

1.2.3 液相色谱-质谱检测条件 参照相关文献[6]设立高效液相色谱-质谱条件，色谱条件为色谱柱：Thermo BDS HYPERSIL C18(100 mm×2.1 mm, 2.4 μm)Part No. 28102-102130，45 ℃柱温，流动相：2 mmoL乙酸铵+0.5‰，甲酸∶甲醇(VV=55∶45)，流速为0.2 mL/min；质谱条件为电喷雾离子源(Turbo Spray)，多级反应监测(multiple reaction monitoring，MRM)，正离子模式，Turbo Gas Temperature(TEM)：550 ℃；Auxiliary Gas(GS2)：30 psi，Nebulizing Gas(GS1)：30 psi，Curtain Gas(CUR)：10 psi，Ion Spray Voltage(IS)：5500 V。

1.2.4 样品采集与处理 分别于给药后5 min、10 min、15 min、30 min、45 min、60 min、90 min、120 min、180 min、240 min、360 min采集药物组和针药组大鼠的眼眶静脉血。将10 μL内标液(7.2088×10-7mol/L泼尼松龙)加入100 μL空白大鼠血浆中，涡旋30 s混匀，加入1ml乙酸乙酯，涡旋混匀3 min，以转速为12000 r/min(rcf)在高速冷冻离心机离心10 min，4℃取800 μL上清液真空浓缩挥干，用100 μl流动相溶解，以20000 rcf的转速在高速冷冻离心机离心10 min，取60 μL上清液，20 μL进样进行LC-MS分析。将色谱峰面积代入回归方程，即求得各时间点大鼠血浆中的TPL浓度。

1.2.5 线性关系考察 图1显示，将7.2088×10-7mol/L的泼尼松龙10 μL加入100 μL大鼠空白血浆中，再分别加入浓度为9.01×10-11、1.802×10-10、3.604×10-10、1.802×10-9、7.208×10-9、1.802×10-8mol/L的TPL系列标准溶液各20 μL，按上述“1.2.4”项方法操作，每个浓度取样5份，分析并记录样品峰和内标峰面积，用样品浓度C对样品峰和内标峰面积的比值A作线性回归，得回归方程y=0.0785x+0.0361，r=0.9969(权重W=1/C2)，TPL在9.01×10-11-1.802×10-8mol/L浓度范围内线性良好。

1.2.6 日内与日间精密度 表1显示，将空白血浆分别配制3个不同浓度(0.5、5、40 ng/ml)的质量监控样品，每个浓度取样5份，共分析3个批次，与标准曲线同批依法进行测定，以同批标准曲线计算样品浓度及批内、批间的相对标准偏差(RSD)，结果表明日间精密度和日内精密度变异均小于5%。

1.2.7 提取回收率及样品稳定性考察 表2显示，各取5份上述不同浓度的样品，将空白样品中添加被测物并经样品处理后的检测信号与血浆处理后加药相应浓度标准液的检测信号进行对比，计算得3个浓度的提取回收率分别为(94.2%±1.7、97.3%±4.1、89.7%±4.5)。仍取上述样品各5份，在室温稳定性、长期及冻融的不同条件下观察其稳定性，结果表明在-20 ℃下保存30 d、室温放置24 h及反复冻融3次的条件下，大鼠血浆中的TPL都具有良好的稳定性(RSD<15%)。

表1 TPL在大鼠血浆中日间、日内精密度比较

表2 TPL在大鼠血浆中的短期、室温和冻融稳定性

1.2.8 肝标本采集与指标检测 处死大鼠，取肝组织置于-80 ℃冰箱中保存，制备匀浆液，采取酶联免疫吸附测定法(Elisa)测定肝组织匀浆中ALT、AST含量及SOD、MDA活性，均严格按照试剂盒规定操作。

2 结果

2.1 足趾体积

表3显示，足趾体积反映了RA大鼠的足趾病变程度。

表3 各组大鼠足趾体积比较

注：与模型组比较：*P<0.05；与电针组比较：ΔP<0.05；与药物组比较：■P<0.05

表3显示,各组大鼠足趾体积治疗前比较差异无统计学意义(P>0.05)，说明各组足趾肿胀程度具有可比性。治疗14 d后，电针组、药物组、针药组的足趾体积与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)，针药组与电针组、药物组比较差异有统计学意义(P<0.05)，说明药物组、电针组及针药组的足趾肿胀程度均较模型组减轻，且疗效最好的为针药组，药物组次之，再次为电针组。

2.2 各时间点血药浓度

表4显示，干预14 d后按“样品采集与处理”中的方法取各时刻大鼠血浆，通过LC-MS测得给药后不同时间点的血药浓度如下。

表4显示，TPL在大鼠体内吸收较快，药物组在给药后10 min左右出现吸收峰，而针药组在给药后5 min左右出现吸收峰，2组120 min时血药浓度均低于检测低限。经统计学分析，药物组和针药组各时间点血药浓度比较差异有统计学意义(P<0.05)。可得出结论，针药组在上述各时间点的血药浓度高于药物组，电针提高了RA大鼠体内的血TPL浓度。

表4 药物组和针药组各时间点血TPL浓度比较

注：与药物组比较:*P<0.05(NA为低于检测低限)

2.3 药动学参数

表5图2显示，运用DAS2.0计算得出药物组和针药组的药动学参数并绘制出AUC。

表5 药物组和针药组药动学指标

注：与药物组比较：*P<0.05

图2 药物组和针药组TPL的AUC比较

表5图2显示，药物组和针药组的AUC变化趋势大体相似，在10 min即达到Cmax，初始血TPL浓度急骤下降，而后速度减缓，360 min后低于检测低限。经DAS2.0分析，电针可以影响TPL在模型大鼠体内的药动学过程：(1)经LC-MS检测，电针“足三里”后的血TPL浓度在同一时间点高于单独口服TPL的浓度，差异有统计学意义(P<0.05)，说明电针可提高同一时间点的血浆TPL浓度；(2)电针“足三里”提前了TPL的Tmax，并提高其Cmax及AUC，差异有统计学意义(P<0.05)，说明电针可提高单位时间血TPL浓度，进而提高其生物利用度。

2.4 ALT、AST含量和SOD、MDA活性

表6显示，针药组肝组织匀浆液中的ALT、AST含量及MDA活性均较药物组降低，而SOD活性则升高(P<0.05)。

表6 药物组与针药组ALT、AST含量及SOD、MDA活性比较

注：与药物组比较:*P<0.05

3 讨论

现代研究表明，电针联合药物能够在一定程度上拮抗药物毒副作用，提高药物生物利用度，促进药物的靶向运动，电针能很好地减轻RA的免疫炎症反应，并能一定程度地抑制TPL对RA的肝毒性。

本研究显示，针药组大鼠足趾肿胀改善情况最好，且电针提升单位时间血TPL浓度、Cmax及AUC，提升TPL的生物利用度，其机制可能与电针增强胃电活动[7]或调控RA的炎症信号传导通路[8]有关，这可作为今后进一步研究的切入点。此外，电针还降低肝组织的ALT、AST含量及MDA活性，升高SOD活性，说明电针减轻TPL所致的肝损害，有助于肝功能恢复[9]和提高肝组织的抗氧化能力。该实验结果也对临床电针结合TPL治疗RA提供了参考性意义，即在临床治疗RA时可将电针与低剂量TPL“足三里”配合干预，提高TPL的生物利用度，节省药物成本；另一方面也提示，TPL剂量应用较大时需慎用电针，以防电针引起血TPL浓度过高而对机体肝、肾、心等多个脏器造成毒性损害。本研究结果为动物药理学和毒理学研究及针药结合治疗RA的安全性和有效性(最佳给药途径、给药间隔时间)提供重要的理论依据，但存在分组较少、动物样本量不足、实验过程欠规范化、穴位选择及操作手法差异性等不足。故实验研究应服务于临床，针对“足三里”的临床功效还需进一步深入研究，通过对比观察不同穴位的疗效，从而为电针结合TPL治疗RA开辟一条新的增效减毒路径。

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ImpactsofPharmacokineticsandLiverDamageIndexesofElectroacupunctureonRheumatoidArthritisRatswithTakingTriptolideOrally

XIAO Yan, ZHANG Hao-ran, CHEN Hao, GU Yi-huang△, HONG Han-Qing

(SecondClinicalMedicalSchool,NanjingUniversityofChineseMedicine,Nanjing210023,China)

Objective: Observe the effect of electro-acupuncture combined with triptolide(TPL)on the digits swelling of rheumatoid arthritis(RA) rats, and influence of electroacupuncture to pharmacokinetic parameters and Liver damage indexes: aspartate aminotrans ferase(ALT)、aspartate aminotransferase(AST)、superoxide dismutase(SOD)、malondialdehyde(MDA) of RA rats with taking TPL orally, which displays the effects of efficacy enhancing and toxicity reducing for TPL-induced liver injury and provides experimental basis for clinical RA treatment of electroacupuncture combined with TPL. Methods:Building RA rats by using freund’s complete adjuvant(FCA);Using liquid chromatography-mass spectrometry to detect the TPL concentration in the plasma, and liver homogenate was prepared to detect the content of ALT、AST and the activity of SOD and MDA by enzyme-linked immuno sorbent assay (Elisa) kit. Results:The improvement situation of digits swelling of RA rats in the electroacupuncture combined with TPL group was best, the drug group followed, and electroacupuncture group came in last;TPL’s concentration in the electroacupuncture combined with TPL group was higher than that in the drug group at the same time, Tmaxin advance, the peak concentration(Cmax) of TPL and area under the curve(AUC) increased, too;Combined with drug group, the content of ALT、AST and the activity of MDA in the electroacupuncture combined with TPL group decreased, the activity of SOD increased. Conclusions: Electroacupuncture at “Zusanli(ST36)” not only can alleviate the digits swelling of RA rats, improve the blood TPL concentration and bioavailability, but also can reduce the liver injury of RA rats caused by oral TPL, and improve the organic ability to resist oxidative stress.

Electroacupuncture; Rheumatoid arthritis(RA); Triptolide(TPL); Pharmacokinetics; Liquid chromatography-mass spectrometry(LC-MS)

R245.9+7

B

1006-3250(2017)09-1284-04

国家自然科学基金面上项目(81674063)-不同时间窗电针干预抗心肌缺血再灌注损伤的自噬相关机制研究;南京中医药大学国家基金预研基金项目(14XYY07)

肖 燕(1988-)，女，广西梧州人，在读硕士，从事艾灸对运动疲劳的防治研究。

顾一煌(1965-)，男，江苏南通人，教授，从事中医药对运动疲劳的防治研究，Tel：025-85811683,E-mail:gyh5196411@163.com。

2017-02-10