翻白草对大鼠溃疡性结肠炎的药效及作用机制研究❋

裴玲燕，张纯芳，刘伟志，柯愈诗，王 琳

(中央民族大学中国少数民族传统医学研究院，北京 100081)

【实验研究】

翻白草对大鼠溃疡性结肠炎的药效及作用机制研究❋

裴玲燕，张纯芳，刘伟志△，柯愈诗，王 琳

(中央民族大学中国少数民族传统医学研究院，北京 100081)

目的：研究翻白草对大鼠溃疡性结肠炎的药效作用，并探讨翻白草治疗UC的可能分子机制。方法：采用三硝基苯磺酸-乙醇灌肠法复制溃疡性结肠炎(UC)大鼠模型，实验分为空白对照组、模型对照组、柳氮磺吡啶组、翻白草低、中、高剂量组6组。连续给药14 d后水合氯醛麻醉，取病变结肠组织石蜡包埋、切片、染色后镜下观察，剩余结肠组织采用western blot方法分别检测TLR4及NF-κBP65。结果：DAI指数及病理形态变化表明，与空白组比较模型组差异有统计学意义，翻白草低剂量组治疗效果最佳；与空白组比较模型组大鼠结肠组织NF-κBP65表达水平显著增加，翻白草给药组均能下调NF-κBP65的表达水平。结论：翻白草能通过调控NF-κBP65表达水平以发挥对UC的治愈作用。

翻白草；溃疡性结肠炎；药效；TLR4；NF-κBP65

翻白草(PotentilladiscolorBunge)通常生长于海拔800～1850 m的荒地、山谷、沟边、山坡草地、草甸及树林，属于蔷薇科多年生草本植物，主要分布于云南、四川、陕西、东北、华北、华东和中南等地。翻白草是凉山彝族人民长期使用的一种常用药物，在当地彝语称之为“瓦子纳子”。翻白草味甘、微苦、性平，归肝、胃、大肠经，具有清火解毒、祛风除湿、消肿止痛、凉血止血的功效，彝医将其用于治疗急慢性腹泻、疟疾、痢疾、泻痢便血、风湿痛等疾病[1]。本实验通过观察翻白草对大鼠溃疡性结肠炎的药效作用及对大鼠结肠组织TLR4、NF-κBP65表达水平的影响，为研究翻白草抗溃疡性结肠炎的机制提供基础实验数据。

1 材料

1.1 动物

SPF级Wistar大鼠，体质量(200±10) g，购自军事医学科学院实验动物中心(许可证号SCXK-(军)2012-0004)，常规饮食，适应性饲养7 d。

1.2 药材与试剂

翻白草采自四川凉山彝族自治州，经中央民族大学中国少数民族传统医学研究院朱丹教授鉴定为蔷薇科翻白草(PotentilladiscolorBunge)全草；柳氮磺吡啶(上海信谊天平药业有限公司，批号09130714)；TLR4-antibody(Santa公司，货号sc-293072);NF-κBP65-antibody(Immunoway公司，货号YM3111)；GAPDH鼠单抗(Immunoway公司，货号YM3029)；三硝基苯横酸(TNBS，sigma公司)。

1.3 实验仪器

酶标仪(BIO-TEK公司)，Elx800洗板机(BIO-TEK公司，Elx50)；高速离心机(上海安亭科学仪器厂，TGL-16B干燥箱(日本三洋，MIR-153型)；低温冰箱(日本三洋，MDF-382E型)；恒温水浴箱(江苏太仓医用仪器厂，DSHZ-300型)；分析天平(瑞士METTLER TOLEDO公司，AL104型)。

2 方法

2.1 分组与模型制备

选取Wistar大鼠80只，体质量(190～210) g，雌雄各半。腹腔注射10%水合氯醛(0.2 ml/100 g)将大鼠麻醉、固定。将外径2.0 mm、长约15 cm的输液管(输液管先用液体石蜡油润滑)，从大鼠肛门逆行插入结肠内深约8.0 cm处，一次性将100 mg/kg TNBS和50%乙醇的TNBS/乙醇液0.25 ml注入大鼠结肠内，用棉签堵住大鼠肛门，轻揉大鼠腹部l min，使TNBS/乙醇液均匀地与大鼠结肠黏膜接触。对照组用同样方法，0.25 ml生理盐水灌肠。3 d后随机选取5只大鼠处死剪取直肠和结肠组织，清洗后肉眼观察结肠组织，并取肠段(10%甲醛溶液中固定)做组织切片以确定造模是否成功。

2.2 分组及给药

实验分为空白组、模型组、柳氮磺吡啶组、翻白草水煎剂高、中、低剂量组，造模成功后给予灌胃治疗14 d，换算成大鼠体质量后每日给药量分别为翻白草水煎剂低剂量组1.6 g/kg、中剂量组3.2 g/kg、高剂量组6.4 g/kg、柳氮磺吡啶组3.6 g/kg，空白组及模型组给予溶媒灌胃。表1显示，给药期间对大鼠疾病活动指数(Disease active index，DAI)进行评分。

表1 DAI评分标准

2.3 大鼠结肠组织病理切片制作

末次给药后次日10%水合氯醛腹腔注射麻醉，取病变部位结肠组织用4%甲醛溶液固定、脱水、石蜡包埋、切片，厚度为5 μm，然后进行脱蜡和复水及苏木精伊红(HE)染色。

2.4 大鼠结肠组织TLR4、NF-κBP65蛋白表达检测

动物常规处死解剖取结肠，剪取新鲜溃疡组织加入RIPA裂解液，低温环境下研磨成组织匀浆液；低温下，利用超声波粉碎仪对组织匀浆液进行超声，工作10 s，间隔 30 s，30 个循环；4 ℃、10000 r·min-1离心 20 min取上清。BCA 法进行蛋白定量后分装，-20 ℃保存备用。制备SDS-PAGE胶，将蛋白转到PVDF膜上，转移膜置于奶粉封闭液中封闭2 h：加一抗孵育2 h，TBST洗膜，加二抗孵育1 h，TBST洗膜，ECL发光试剂发光，胶片曝光、显影定影。扫描图像，凝胶图像分析软件分析条带积分值。以各细胞因子及其受体蛋白条带的积分值与β-actin的比值作为蛋白表达量。

2.5 统计学方法

3 结果

3.1 DAI评分

表1显示，UC模型复制成功后，按表1进行DAI评分。给药第1天至第10天，模型组DAI值趋于稳定，第11天开始模型组DAI值呈下降趋势，说明大鼠本身具有一定自愈能力；翻白草高、中、低剂量组DAI值始终处于下降趋势，表明翻白草对UC模型大鼠的溃疡有较好的治疗效果(图1)。

图1 DAI评分结果

3.2 病理学形态变化

图2 各组大鼠结肠病理组织学观察

低倍镜下观察发现，空白组肠壁四层结构明显，大肠腺排列规则；模型组溃疡明显且溃疡面积较大，肠壁四层结构不明显，其中黏膜层和黏膜下层中有丰富的炎症细胞；阳性药组结肠四层分层明显，黏膜固有层、黏膜下层甚至肌层可见大量弥散淋巴细胞；高剂量组结肠四层分层明显，大肠腺排列整齐；中剂量组结肠四层结构分层明显，在黏膜下层可见较大淋巴小结，大肠腺部分扩张；低剂量组肠壁四层结构明显，大肠腺排列整齐，但在黏膜下层和黏膜固有层可见大量弥散的炎症细胞。高倍镜下观察发现，空白组肠壁黏膜层三层结构完整；模型组结肠溃疡处有丰富的炎症细胞，溃疡边缘大肠腺排列紊乱，腺体扩张；阳性药组结肠大肠腺排列紊乱，腺体扩张，黏膜固有层有较多炎症细胞存在；高剂量组结肠黏膜层三层结构明显，在黏膜固有层有丰富的弥散淋巴细胞，黏膜下层可见一淋巴细胞团存在；中剂量组结肠黏膜固有层有大量淋巴细胞存在，腺体轻度扩张；低剂量组结肠黏膜层三层分层明显，腺体排列整齐，但黏膜固有层和黏膜下层有许多弥散淋巴细胞和中性粒细胞存在。

3.3 各组大鼠结肠组织TLR4、NF-κBP65蛋白表达变化

与模型组比较，空白组结肠组织NF-κBP65的表达差异有统计学意义(P<0.01)；翻白草低、中、高剂量组比较差异有统计学意义(P<0.05)，柳氮磺吡啶组比较差异无统计学意义。与模型组比较，TLR4的表达与各组比较差异无统计学意义。

表2 TLR4、NF-κBP65蛋白表达水平比较(灰度比值

注：与模型组比较:*P<0.05，**P<0.01

图3 蛋白表达水平注：1.空白组；2.模型组；3.阳性药组；4.低剂量组；5.中剂量组；6.高剂量组

4 讨论

翻白草(PotentilladiscolorBunge)又名鸡距草、天青地白、鸡腿儿、鸭脚参、鸡脚草，为蔷薇科(Rosaceae)植物翻白草的带根全草，因叶下发白被命名为“翻白草”[2]。使用时采摘全草，除去泥沙杂质、洗净，切成段晒干后在通风干燥处收藏备用。李时珍云：“翻白，以叶之形名；鸡腿、天藕，以根之味名也。楚人谓之湖鸡腿，淮人谓之天藕。[3]”《本草纲目》《救荒本草》《现代实用中药》等古籍均有记载。翻白草味甘、微苦、性平，归肝、胃、大肠经，具有止血止痢、清火解毒、祛风除湿、消肿止痛、凉血止血、降低血糖的功效。近年来，广泛用于治疗糖尿病，彝医将其用于治疗疟疾、痢疾、泻痢便血、痈肿疮毒、风湿痛和月经不调等疾病[1]。本实验据此研究翻白草对大鼠溃疡性结肠炎的治疗作用，并初步探究其作用机制。溃疡性结肠炎属于炎症性肠病, 其病因和发病机制尚不明确, 可能是多种因素共同作用的结果。有研究发现，促炎因子如IL-1、IL-2、IL-6、IL-8、IFN、TNF等, 抗炎因子如IL-4、IL-10、IL-13等均与溃疡性结肠炎的发病及病程进展有关[4]。NF-κB是一种具有多向转录调节作用的转录因子, 参与众多炎症反应相关基因的转录调控。NF-κB最常见的形式是由 p50 和 p65 亚单位组成的异二聚体，p65 亚单位是主要的促炎单位, 其活化在UC发病中起关键作用, 许多与 UC 相关的促炎细胞因子都存在NF-κB 结合位点[5-6]。其活化可以控制各种促炎因子的基因转录, 因此它对溃疡性结肠炎发病机制的研究具有重要意义。炎症性肠病患者结肠上皮细胞和巨噬细胞中的NF-κB可被活化。本实验发现，翻白草给药组可抑制转录因子NF-κB的表达，而HE染色及DAI评分结果表明，翻白草给药组可有效缓解UC模型大鼠的腹泻便血症状，改善其活动性，并对溃疡性结肠炎结肠黏膜有一定的修复作用。由此推测，翻白草是通过抑制转录因子NF-κB的表达，调控炎症因子网络，从而改善大鼠溃疡性结肠炎的症状，具体细胞作用通路需进一步的实验验证。Toll样受体(toll-like receptors，TLRs)[7-8]是重要的介导肠黏膜先天防御反应的介质，在维持肠黏膜和肠道微生态稳定中发挥着重要作用。迄今为止，已发现13种TLRs(TLR1-13)。TLRs是以模式识别受体(patterns recognition receptors，PRR)的方式识别微生物抗原，不同TLRs识别不同的配体。有研究[9]表明，TLR/MyD88(髓样分化因子)信号通路可调控下游核转录因子，调控UC细胞因子水平，从而介导免疫炎症反应，导致UC发生。MyD88信号传导途径是TLR信号传导的共同通路(TLR3除外)，TLR1-9均能通过MyD88途径完成信号传导。本实验对照组及给药组TLR4表达水平均未发生显著变化，可能与TNBS诱导的炎症性肠病模型并未产生TLR4相关识别配体有关，而NF-κB信号传导途径为TLR/MyD88信号通路的传导途径之一。本实验NF-κB发生显著变化，可能是其他TLRs受体参与完成TLR/MyD88-NF-κB信号通路，需进一步实验验证。

[1] 杨本雷.中国彝族药学[M].昆明：云南民族出版社，2004:313-314.

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StudyontheEffectandMechanismofPotentillaDiscoloronUlcerativeColitisinRats

PEI Ling-yan, ZHANG Chun-fang, LIU Wei-zhi△, KE Yu-shi, WANG Lin

(InstituteofChineseMinorityTraditionalMedicine,MinzuUniversityofChina,Beijing100081,China)

Objects: To study the pesticide effectiveness of Potentilla discolor Bunge on treating ulcerative colitis(UC) rats, and to explore the molecular mechanism of Potentilla discolor Bunge in the treatment of UC. Methods: The UC rats were induced by trinitrobenzene sulfonic acid-ethanol enema. The rats were divided into six groups: blank control group, model control group, sulfasalazine group, low potentilla discolor, Middle and high dose groups. After 14 consecutive days, chloral hydrate was used to make the rats narcotized and colonic tissue was embedded in paraffin,serially cut and stained for microscopic observation. TLR4 and NF-κBP65 in the remaining colon tissue were detected by western blot. Results: Compared with the blank control group, the DAI index and pathological morphologic change in the model group were significantly different. The therapeutic effect in low-dose group was the best. Compared with the blank control group, the expression of NF-κBP65 was significantly increased in the model group. All the Potentilla discolor Bunge groups could down regulate the NF-κBP65 expression level. Conclusion: Potentilla discolor Bunge could exert its effect on UC by regulating the expression level of NF-κBP65 in UC rats.

PotentilladiscolorBunge; UC; Pharmacological function; TLR4; NF-κBP65

R574.62

B

1006-3250(2017)09-1238-03

中央高校基本科研业务费资助项目(2015MDQN15)-基于肠黏膜屏障损伤修复的彝药翻白草抗UC药效评价及作用机制研究

裴玲燕(1989-)，女(朝鲜族)，黑龙江牡丹江人，在读博士，从事民族医药开发研究。

刘伟志(1981-)，男(回族)，吉林长春人，高级工程师，医学博士，从事民族医药开发研究，Tel：010-68939942。

2017-03-17