脾虚1号方对脾虚型功能性消化不良大鼠肝脏细胞色素C氧化酶IV的影响❋

吕 林，王凤云，唐旭东，马祥雪，尹晓岚，石啸双

(1. 中国中医科学院西苑医院消化科/北京市中医脾胃病研究所，北京 100091； 2. 北京中医药大学研究生院，北京 100029； 3. 中国中医科学院研究生院，北京 100700)

【实验研究】

脾虚1号方对脾虚型功能性消化不良大鼠肝脏细胞色素C氧化酶IV的影响❋

吕 林1，王凤云1，唐旭东2△，马祥雪2，尹晓岚3，石啸双3

(1. 中国中医科学院西苑医院消化科/北京市中医脾胃病研究所，北京 100091； 2. 北京中医药大学研究生院，北京 100029； 3. 中国中医科学院研究生院，北京 100700)

目的：探讨脾虚型功能性消化不良(FD)大鼠肝组织细胞色素C氧化酶IV(COX IV)蛋白与基因表达及脾虚1号方干预。方法：70只10 d龄雄性SD大鼠按随机数字表法分为正常对照组(10只)、FD模型组(单模型组10只)、脾虚型FD模型组(50只)。正常组给予2%蔗糖溶液灌胃，FD模型组和脾虚型FD模型组均给予0.1%蔗糖碘乙酰胺蔗糖溶液灌胃，0.2 mL/只·d，连续6 d。脾虚型FD模型组正常饲料喂养至6周龄后叠加改良小平台站立，连续14 d；造模结束后按随机数字表法分为双模型组、多潘立酮组、脾虚1号方低、中、高剂量组各10只，药物干预14 d，采用免疫组化、Western-blot和RT-PCR方法检测肝脏组织COX IV蛋白与mRNA表达量。结果：与正常组比较，双模型组大鼠肝脏COX IV mRNA表达量和平均光密度值显著降低；与双模型组比较，脾虚1号方高剂量组大鼠肝脏COX IV mRNA和蛋白表达量升高。结论：脾虚型FD大鼠存在COX IV mRNA和蛋白表达量降低现象，脾虚1号方可能是通过上调COX IV蛋白与mRNA的表达提高脾虚证大鼠能量代谢。

脾虚证；功能性消化不良；细胞色素C氧化酶；中医

中医学认为，脾为“后天之本，气血生化之源”。随着上世纪80年代刘友章教授“中医脾-线粒体相关”学说的首次提出[1]，对中医脾的生理功能与线粒体的功能特点关系的研究不断深入。线粒体呼吸链酶复合物IV又称为细胞色素C氧化酶(cytochrome c oxidase,COX)，位于线粒体呼吸电子传递链的终点，是线粒体氧化能力的关键调节部位，来自线粒体复合体I、Il和III的电子经过细胞色素c在这里最终传递给氧分子，每传递1个电子的同时，将1个质子从线粒体基质转移到线粒体膜间隙，并消耗掉基质中的1个质子，在能量产生中起主要作用[2]。为进一步深入对中医脾虚证的研究，了解COX与功能性消化不良(functional dyspepsia，FD)的关系，本研究以脾虚型FD大鼠为模型，以线粒体呼吸链的终端酶-COX为研究对象，对功能性胃肠疾病及中医脾虚证之间的差异，以及脾虚1号方对COX IV蛋白及基因水平的影响进行研究。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级SD雄性乳鼠70只，7 d龄带母鼠，每只母鼠带10只幼鼠，为其提供母乳。母鼠与所带幼鼠为一笼，饲养于清洁级动物房，12 h节律，室温(22±2) ℃，湿度60%～70%。母鼠以全价颗粒饲料喂养，自由饮水。实验动物均由斯贝福(北京)实验科技有限公司提供(许可证号SYXK(京)2013-0012，合格证号11401500004829)。

1.2 试剂及仪器

小鼠抗COX IV单克隆抗体(批号ab131177)，艾博抗(上海)贸易有限公司；HRP标记的山羊抗小鼠IgG，圣克鲁斯生物技术公司(型号Sc-2005)；涡旋振荡仪(型号QL-902)，海门市其林贝尔仪器制造有限公司；分光光度计(型号NANODROP 2000)，赛默飞世尔科技公司；荧光定量PCR仪(型号ABI7500)，美国应用生物系统公司；酶标仪(型号MULTISKAN MK3)，赛默飞世尔科技公司；电泳仪(型号VE-180)，上海天能科技有限公司；转膜仪(型号VE-186)，上海天能科技有限公司；凝胶成像仪(型号6100)，赛智科技(杭州)有限公司；Image-pro Plus 6 图形处理软件。

1.3 实验药物

碘乙酰胺(批号1001437587)，西奥格玛公司；蔗糖，拜尔迪公司(批号0552C003)；多潘立酮片，西安杨森制药有限公司(批号141124263)；脾虚1号方(香砂六君子汤加减)由中国中医科学院西苑医院药剂科制作。

1.4 造模与分组

参照文献[3]，健康雄性SPF级SD大鼠乳鼠70只，根据体质量随机分成正常组10只、FD模型组(单模型组10只)和脾虚型FD模型组50只。正常组每日2%蔗糖溶液灌胃，FD模型组和脾虚型FD模型组每日0.1%蔗糖碘乙酰胺溶液灌胃，每只0.2 mL，连续灌胃6 d。大鼠3周龄时剔除母鼠分笼，每笼5只，正常鼠饲料喂养。至大鼠6周龄后，正常组继续给予正常鼠饲料喂养。脾虚型FD模型组叠加改良小平台法[4]：向小平台站立箱(110 cm×60 cm×40 cm)水槽中注水，水温控制在(22±2) ℃，注水量以水面达到小平台台面下2.0 cm为宜。大鼠在小平台上可以自由活动但不能休息，以此造成大鼠劳倦。每日17∶00～7∶00进行小平台站立，持续14 h，连续14 d。造模结束后，将脾虚型FD大鼠按随机数字表法分为双模型组、多潘立酮组、脾虚1号方低、中、高剂量组各10只。

1.5 给药

脾虚1号方中剂量组按大鼠用药剂量=g/60 kg×6.25公式计算，60 kg成人使用脾虚1号方的原生药量为125 g，对应大鼠生药用量为1.3 g/100 g，按照1 g颗粒剂含有5.1 g生药计算，每只大鼠灌胃给药量为0.255 g/100 g。按照每只大鼠100 g灌胃1 mL溶液计算，低、中、高剂量每只大鼠灌胃0.1275、0.2550、0 .5 100 g·100 g-1·d-1，每日1次；按照多潘立酮成人每次1片，每日3次，60 kg成人使用量是30 mg/60 kg，SD大鼠使用量为0.3 125 mg·100 g-1·d-1；正常组、单模型组和双模型组灌服蒸馏水量为1 mL·100 g-1·d-1，每日上午灌胃给药1次，连续用药14 d。

1.6 取材

在末次给药禁食不禁水12 h，麻醉前1 h称重，7%水合氯醛(0.5 mL·100 g-1)麻醉开腹，剪取肝脏组织约2 cm×1.5 cm，4℃生理盐水冲洗，滤纸吸干，放入液氮中，然后转移到-80 ℃冰箱中保存待测。另剪取肝脏组织约1.5 cm×1.0 cm，以4 ℃生理盐水冲洗、滤纸吸干后，置入4%多聚甲醛固定液中，脱水、石蜡包埋、切片备用。

1.7 检测

1.7.1 免疫组化法测定大鼠肝脏组织中COX IV表达量 取肝脏组织石蜡切片常规脱蜡水化，PBS(pH7.4)冲洗3 min×3次；滴加50 μL过氧化酶阻断溶液，室温孵育10 min，PBS冲洗3 min×3次；滴加50 μL一抗，4 ℃过夜，PBS冲洗3 min×3次；滴加50 μL生物素标记的二抗，室温孵育10 min，PBS冲洗3 min×3次；滴加5 μL链霉素抗生物素-过氧化物酶溶液，室温孵育10 min，PBS冲洗3 min×3次；DAB显色，苏木素复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。Image-pro Plus 6 图形处理软件系统分析，高倍显微镜(×200)下观察结肝脏组织横断面单位面积上COX IV的表达量，每张切片随机观察5个视野，分别统计然后求取每组大鼠COX IV表达量的平均值。

1.7.2 Western-blot检测COX IV蛋白表达 将肝脏样本低温研磨加入RIPA裂解液，碧云天BCA工作液于紫外分光光度仪上测定蛋白浓度。样品上样，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，半干电转膜仪转膜。封闭后按照封闭液=1∶10000的比例配置一抗孵育液，4 ℃过夜。洗膜3次，加入HRP标记的山羊抗小鼠抗体振荡。将PVDF膜于室温下振荡温育。ECL显色，X线胶片曝光，经显影、定影、扫描后观察结果。应用Quantity one软件对扫描图像的目的条带进行吸光度分析，各目的条带与GAPDH的吸光度比值为目的蛋白的相对表达量。

1.7.3 RT-PCR法检测COX IV mRNA表达 从-80℃超低温冰箱取出肝脏组织，在研磨器中研磨裂解后离心。肝脏组织总RNA提取严格按试剂盒说明进行，所提总RNA经核酸测定仪测定样品RNA含量和纯度。根据总RNA含量逆转录为cDNA，以此cDNA为模板进行PCR扩增，COX IV及GAPDH特异性引物由北京亿鸣复兴生物科技有限公司设计合成。引物序列：上游引物5’-TGG GCA GCA GTG GCA GAA TGT-3’，下游引物5’-CCC GAA GGC ACA CCG AAG TAGA-3’，扩增片段长度84 bp；GAPDH的上游引物5’-TGG AGT CTA CTG GCG TCTT-3’，下游引物5’-TGT CAT ATT TCT CGT GGT TCA-3’，扩增片段长度138bp。反应条件如下：先94 ℃预变性5 min后，94 ℃变性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸10 s，总共36个循环，最后72 ℃延长5 min。用1%琼脂糖凝胶进行电泳后，采用6100型凝胶成像仪软件分析。用ABI 7500型荧光定量PCR仪，采用2-△△Ct进行相对定量，表示该基因的相对表达水平。

1.8 统计学方法

2 结果

2.1 免疫组化结果

图1表1显示，各组肝脏组织细胞胞浆可见棕黄色颗粒。与正常组比较，双模型组大鼠肝脏COX IV蛋白平均光密度值显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。与双模型组比较，脾虚1号方中、高剂量组升高最显著，差异有统计学意义(P<0.05)。

图1 各组大鼠肝组织COX IV蛋白免疫组化观察(×200)注：A.正常组;B.双模型组(脾虚型FD模型);C.多潘立酮组;D.脾虚1号方低剂量组;E.脾虚1号方中剂量组;F.脾虚1号方高剂量组;G.单模型组(FD模型)(下同)

组别COXIV平均光密度值(n=4)COXIV灰度值(n=6)COXIVmRNA(n=6)正常组0.02024±0.00291.4440±0.607711.1233±3.0482双模型组0.01390±0.0009*0.5877±0.04112.9023±0.3862*多潘立酮组0.02230±0.00460.2640±0.0726△4.9782±0.4081△△脾虚1号方低剂量组0.03100±0.00920.7159±0.1379##3.2590±0.5014*#脾虚1号方中剂量组0.03450±0.0084△#0.3231±0.14632.0262±0.4170*##脾虚1号方高剂量组0.05520±0.0172△##1.1873±0.2299△△##6.7938±0.4677△△#单模型组0.01640±0.00490.9696±0.1930##5.1363±0.3686△△

注：与正常组比较：*P<0.05；与双模型组比较：△P<0.05，△△P<0.01;与多潘立酮组比较：#P<0.05，##P<0.01

2.2 Westren-blot检测COX IV蛋白表达量

图2表1显示，与正常组比较，双模型组大鼠肝脏COX IV蛋白表达量降低，差异无统计学意义(P>0.05)。与双模型组比较，多潘立酮组降低，而脾虚1号方高剂量组则升高，差异有统计学意义(P<0.01，P<0.05)。

图2 各组大鼠肝脏组织COX IV蛋白电泳注：A.双模型组;B.脾虚1号方中剂量组;C.脾虚1号方低剂量组;D.单模型组(FD模型);E.脾虚1号方高剂量组;F.多潘立酮组;G.正常组

2.3 RT-PCR检测COX IV mRNA表达量

表1显示，与正常组比较，双模型组大鼠肝脏COX IV mRNA表达量显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。与双模型组比较，多潘立酮组、脾虚1号方高剂量组、单模型组显著升高，差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)。

3 讨论

COX是一种异源寡聚酶，通常含有13个亚基，定位于线粒体内膜，是线粒体呼吸链的酶复合物，它可以从每4个还原性细胞色素c中得到1个电子，传递给1个氧分子，最终把1个氧分子转变成2个水分子。在此过程中，COX会结合4个质子用于产生2个水分子，同时把4个质子转移到膜的另外一侧产生质子梯度，即建立跨膜的电化学势，随后ATP合成酶可以利于该电化学势合成ATP。在所有哺乳动物真核细胞中，COX是由细胞核和线粒体DNA双编码合成，其中COX I、COX II和COX III亚基是由线粒体DNA编码，在进化过程中非常保守，并形成一定的催化反应中心。COX IV、C0X Va、C0X Vb、COX VIa、COX VIb、COXVIc、COX VIIa、C0X VIIb、COX VIIc和COX VIII亚基由细胞核基因编码，指导COX的正确装配，维持结构稳定[5]。

FD是一种常见的临床慢性疾病，其病理机制主要涉及胃动力障碍占23%，内脏高敏感占35%，胃容受性舒张障碍为40%[6]。FD亚型餐后不适综合征(postprandial distress syndrome,PDS)患者胃电节律紊乱可能与腹胀、腹部不适、早饱等消化不良症状有关，其机制可能是胃电节律紊乱引起胃部肌肉收缩异常、胃排空障碍或胃动力低下[7]。FD患者存在胃动力障碍，可能是由于ATP供应不足导致平滑肌收缩减弱，中医脾虚则出现疲倦、乏力等症状，可能会进一步加重FD症状。正如《素问·太阴阳明论》所说：“今脾病不能为胃行其津液，四肢不得禀水谷气，气日以衰，脉道不利，筋骨肌肉，皆无气以生，故不用焉。”COX是线粒体呼吸链电子传递的终末复合物，是ATP产生的关键酶。COX IV在线粒体基因组与核基因组在转录、翻译及COX活性等水平上均出现协同效应。既往有研究发现[8]，白种人线粒体DNA单倍型H(7028C)与疾病易感性相关，其中H型组带有3010G 的患者常常表现胃排空减慢，而带有3010A的患者常常伴有慢性腹痛及消化不良。既往主要是针对器质性疾病及COX活性进行研究[9-10]，本次以功能性胃肠病之FD对象，从COX IV核基因与蛋白表达角度来进行研究。结果发现，双模型组大鼠RT-PCR检测肝脏COX IV mRNA表达量、Western-blot检测COX IV蛋白灰度值、免疫组化检测COX IV蛋白光密度值均较正常组显著降低，提示脾虚型FD大鼠存在COX IV蛋白和基因降低现象。

本次使用的脾虚1号方是在六君子汤的基础上加延胡索、枳壳等药物组成，临床治疗脾虚气滞证FD有很好的疗效[11]。为更好地探讨脾虚1号方作用机制，选择合适的FD动物模型非常重要[12]。本次使用的脾虚型FD大鼠动物模型具有中医脾虚证和FD病理特点[13]。给予药物干预后，脾虚1号方高剂量组大鼠RT-PCR检测肝脏COX IV mRNA表达量、Western-blot检测COX IV蛋白灰度值、免疫组化检测COX IV光密度值均较双模型组升高，提示脾虚1号方能够上调脾虚型FD大鼠肝脏组织COX IV蛋白和mRNA的表达。本次研究还发现，脾虚I号方具有一定的量效关系，高剂量上调COX IV蛋白和mRNA的表达更显著。由于COX是由13个亚单位构成，受到核基因编码的COX IV占其中一部分，因此对于COX在线粒体呼吸链中能量的产生会有一定的影响。中药健脾方治疗脾虚型FD健脾促动力的作用机制，可能是通过提高COX IV基因及蛋白的表达来提高COX在线粒体呼吸链中的作用。

本研究表明，脾虚型FD模型大鼠存在肝脏组织COX IV mRNA及蛋白表达降低现象，脾虚1号方能够上调COX IV基因及蛋白表达，进而提高能量代谢。既往研究提示，消化系统疾病存在线粒体基因组的异常，如胃肠肿瘤、功能性胃肠疾病等，由于目前整个COX的调节和各个亚基之间的相互作用还不甚清楚，COX IV能否作为脾虚型FD预后标志或治疗靶点，值得深入研究。

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EffectofSpleenDeficiency1PrescriptiononCytochromeCOxidaseIvinLiverofRatswithSpleenDeficiencyTypeFunctionalDyspepsia

LV Lin1, WANG Feng-yun1, TANG Xu-dong1△, MA Xiang-xue2, YIN Xiao-lan3, SHI Xiao-shuang3

(1.DigestivedepartmentofXiYuanHospitalChinaAcademyofChineseMedicalSciences/BeijingInstituteofSpleenandStomachDiseaseofTraditionalChineseMedicineBeijing，Beijing100091,China; 2.GraduateschoolofBeijingUniversityofChineseMedicine，Beijing100029,China; 3.GraduateschoolofChinaAcademyofChineseMedicalSciences,Beijing100700，China)

Objective: To investigate the expression of COX IV protein and mRNA in Liver tissue of Dyspepsia rats with spleen deficiency type and the intervention by Pixu I Recipe.Method:70 10-day-old male SD rat pups were randomly divided into normal group(n=10), FD model group(single model,n=10),FD with spleen deficiency model group(n=50).The normal control group were gavaged with 0.2 mL of 2% sucrose, meanwhile, the FD with spleen deficiency model group were gavaged with 0.2 mL of 0.1% IA in 2% sucrose,for 6 days.To postnatal 43 day, the FD with spleen deficiency model group was given modified multiple platform method(MMPM), continued 14h every day, for 14 days.The FD with spleen deficiency model group were averagely randomly divided into double model group,domperidone group,low-dose,medium-dose and high-dose Chinese herbs group, and treated by drug for 14d. To detect the COX IV protein expression in liver tissues by immunohistochemistry, Western-blot and RT-PCR. Results: Compared with the normal group, the mRNA and protein expression of COX IV of double model group were significantly decreased; Compared with the double model group, the mRNA and protein expression of COX IV of high-dose Pixu I Recipe group were increased.Conclusion: The FD Rats with Spleen Deficiency had the phenomenon of low expression of COX IV mRNA and protein, and Pixu I Recipe could increase the expression of COX IV protein and mRNA, and then to promote metabolic energy.

Spleen deficiency syndrome; Functional dyspepsia; Cytochrome c oxidase; Traditional Chinese medicine

国家重点基础研究发展计划(2013CB531703)-“脾失健运”所致功能性胃肠病“从脾论治”疗效及机制研究；国家自然科学基金青年基金项目(81503567)-基于STIM/TRPC/SOCC通路探讨脾虚型FD大鼠胃动力障碍及香砂六君子汤干预机制；中国博士后科学基金面上项目(2015M1227)-基于IP3/Ca2+通路探讨香砂六君子汤干预脾虚型FD大鼠作用机制；中国博士后科学基金特别资助项目(2016T90195)-基于H+/PAR2/TRPV1通路探讨香砂六君子干预FD大鼠机制

吕 林(1983-)，男，安徽合肥人，主治医师，医学博士，从事功能性胃肠病的中医药临床与研究。

唐旭东(1963-)，男，江苏沭阳人，主任医师，医学博士，博士研究生导师，E-mail：txdly@sina.com.cn。

R285.5

B

1006-3250(2017)09-1234-04

2017-03-09