护脉散对静脉炎小鼠血管内皮E-selectin、ICAM-1表达影响的研究❋

邱 敏，刘 莉，邹文娟，孙 科

(1. 重庆市中医院，重庆 400021； 2. 重庆医科大学实验教学中心，重庆 401331)

【实验研究】

护脉散对静脉炎小鼠血管内皮E-selectin、ICAM-1表达影响的研究❋

邱 敏1，刘 莉2Δ，邹文娟1，孙 科1

(1. 重庆市中医院，重庆 400021； 2. 重庆医科大学实验教学中心，重庆 401331)

目的: 观察护脉散对长春瑞滨致静脉炎小鼠血管内皮细胞黏附分子表达的影响。方法: 尾静脉注射长春瑞滨致小鼠静脉炎模型，采用预防和治疗两种方式给予低、中、高剂量护脉散，以多磺酸黏多糖乳膏为阳性对照药物，比较各组小鼠鼠尾肿胀度变化，观察各组小鼠尾静脉血管内皮细胞E-选择素(E-selectin)、P-选择素(P-selectin)、细胞间黏附分子(ICAM-1)、血管细胞间黏附分子(VCAM-1)表达变化。结果: 不同剂量护脉散均能减轻静脉炎小鼠鼠尾炎性肿胀，疗效呈剂量依赖性。模型组小鼠E-selectin和ICAM-1表达明显高于空白组，护脉散高剂量预防组和治疗组小鼠E-selectin和ICAM-1的表达量均较模型组明显降低，给药前后各组小鼠P-selectin及VCAM-1均未见阳性表达。结论:E-selectin和ICAM-1参与了长春瑞滨致化疗性静脉炎的发生，“护脉散”能抑制长春瑞滨导致的血管内皮细胞E-selectin和ICAM-1的表达，从而有效防治静脉炎。

静脉炎；长春瑞滨；护脉散；黏附分子；血管内皮细胞

输液性静脉炎是常见的药源性疾病，有报道其在化疗患者中发生率高达30%～55%[1-2]，又称化疗性静脉炎，严重影响肿瘤患者治疗的依从性和生活质量。长春瑞滨(vinorelbine,VIN)是临床常用的化疗药物，文献报道外周静脉输注时静脉炎发生率高达30%～45%[3-4]，但其发生机制并不完全清楚，公认的理论是化疗药物引起血管内皮的化学性损伤，导致无菌性炎症甚至血栓的形成[5-6]。目前，炎症反应中炎性细胞的募集过程已被较充分的揭示，即白细胞在血管内皮表面的滚动、黏附、血管内爬行、渗出及周围组织中迁移，不同步骤均伴有不同种类的黏附分子的激活和表达[7]。然而，黏附分子在血管内皮细胞的表达与VIN致化疗性静脉炎发生机制的关系并不完全清楚[8]，其关键分子有待揭示。

护脉散是重庆市名中医曾定伦的经验方，临床应用于化疗性静脉炎的防治，累计使用超过1000例，取得了较好的临床疗效。既往研究显示，该药物预防和治疗化疗性静脉炎，疗效优于临床常用药物[9-10]。本研究拟通过观察长春瑞滨对小鼠尾静脉血管内皮细胞细胞间黏附分子表达的影响，研究所致化疗性静脉炎的发生机制，探讨护脉散防治化疗性静脉炎的疗效机制，并以多磺酸黏多糖乳膏作为阳性对照。

1 材料与方法

1.1 动物与分组

健康成年昆明种小鼠120只，雌雄各半，6～8周龄，体质量(25±6) g，重庆医科大学实验教学中心提供。按随机数字表法分为空白组、模型组各20只，护脉散高、中、低剂量预防组、多磺酸黏多糖乳膏预防组、护脉散高、中、低剂量治疗组和多磺酸黏多糖乳膏治疗组各10只。

1.2 药品和仪器

重酒石酸长春瑞滨注射液(10 mg/ml，江苏连云港豪森药业股份有限公司，批号20150211)；多磺酸黏多糖乳膏(德国路易坡大药厂，14 g/支，进口药品注册号H20110296)；0.9%氯化钠注射液(10ml/支，西南药业股份有限公司，批号20150621)；护脉散(芒硝、生大黄、黄连、黄芩、白芷，上5味药物按一定比例粉碎过100目筛，按4∶6质量比分别称取药粉和药用凡士林，凡士林水浴加热融化后，加入药粉，不断搅拌混匀致冷却)；E-selectin、P-selectin、ICAM-1、VCAM-1抗体(武汉博士德生物工程有限公司)；SP 超敏试剂盒(福州迈新生物技术开发公司)；BI-2000医学图像分析系统(成都泰盟科技公司)；电子数显卡尺(上海工具厂有限公司)；微量恒速注射泵(美国BSA公司)。

1.3 给药方法

参照马丽娟[11]方法制备长春瑞滨致静脉炎模型，于小鼠尾静脉近、中1 /3处向近心端穿刺成功后，空白组按5ml/Kg(体质量)给予0.9%氯化钠注射液注射，其余9组均给予10 mg/ml长春瑞滨注射液静脉注射，给药量为56.25 mg/kg(体质量)，给药速度0.25 μL/s。(1)注射给药的同时预防组小鼠于穿刺点近心端上方均匀涂药(涂满鼠尾全周)，护脉散高、中、低剂量预防组分别涂药1.5 g、1.0 g、0.5 g，多磺酸黏多糖乳膏预防组每只涂药1.0 g，间隔4 h后再次涂擦药物1次；(2)注射给药24 h后各治疗组小鼠据上述方法给药，每次间隔6 h，共计给药3次，模型组小鼠不做任何处理。

1.4 指标检测

1.4.1 鼠尾肿胀度检测 给药前、给药6 h、给药24 h、给药48 h后，均于穿刺点近心端上方3 cm处用电子数显卡尺测量鼠尾直径，计算肿胀程度。肿胀度=[(注射后鼠尾直径- 注射前鼠尾直径)/注射前鼠尾直径] ×100%。

1.4.2 SP法免疫组化染色 (1)静脉给药6 h后，脱颈处死空白组、模型组各10只及护脉散高剂量预防组全组小鼠；(2)静脉给药后48 h后处死空白组、模型组剩下的10只及护脉散高剂量治疗组全组小鼠。取各组小鼠尾部从静脉穿刺点至以上5 cm尾部组织，迅速置于10%福尔马林溶液中固定4 h以上，以20%EDTA进行脱钙处理后1wk，再制作成石蜡切片；(3)免疫组化染色后，胞质中黄褐色为阳性细胞。在高倍视野下(×400)采用BI-2000医学图像分析系统测定阳性区域面积，计算其阳性表达积分吸光度，以平均光密度(mean optical density，MOD)反应蛋白的表达水平高低。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 各组鼠尾肿胀度比较

表1显示，与空白组比较各组小鼠给药后6、24、48 h鼠尾肿胀度明显增加(P<0.05或P<0.01)，证明造模方法成功；给药6 h后，护脉散高剂量预防组小鼠鼠尾肿胀度较模型组明显减小(P<0.05)，而护脉散中、低剂量预防组及多磺酸黏多糖乳膏预防组小鼠鼠尾肿胀度虽较模型组小，但差异无统计学意义(P>0.05)；给药48 h后，护脉散高、中、低剂量治疗组和多磺酸黏多糖乳膏治疗组小鼠鼠尾肿胀度与模型组比较明显减轻(P<0.05或P<0.01)，而护脉散高、中剂量治疗组与多磺酸黏多糖乳膏治疗组比较，鼠尾肿胀度减轻更加明显(P<0.05)。

2.2 各组小鼠尾静脉血管内皮细胞E、P-selection表达比较

表2图1显示，模型组和护脉散预防组小鼠尾静脉给予VIN6h后，与空白组比较血管内皮细胞表面迅速表达E-selection(P<0.01)；护脉散预防组与模型组比较， 血管内皮细胞E-selection量表达明显降低；给药48 h后，模型组尾静脉血管内皮细胞E-selection表达量较本组给药6 h后明显降低(P<0.05)，而护脉散治疗组与模型组比较降低明显；图2显示，各组小鼠给药后6 h及48 h，P-selection在尾静脉血管内皮细胞表达量很小，其光密度值与空白组给药后比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3 各组小鼠尾静脉血管内皮细胞ICAM-1、VCAM-1表达比较

表3图3显示，模型组小鼠给予VIN6h后，与空白组比较尾静脉血管内皮细胞已有ICAM-1表达(P<0.05)；护脉散高剂量预防组给药6 h后尾静脉血管内皮亦可见ICAM-1表达阳性细胞，但与模型组比较表达量明显减少(P<0.05)；给药48 h后，模型组尾静脉血管内皮细胞ICAM-1表达量较本组给药6 h后及空白组明显升高(P<0.01)；护脉散高剂量治疗组与模型组比较，尾静脉血管内皮细胞ICAM-1表达量明显降低(P<0.01)；图4显示，各组小鼠给药后6 h及48 h，尾静脉血管内皮细胞VCAM-1表达量无明显变化，差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 各组鼠尾肿胀度比较

注：与空白组比较:*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较:#P<0.05,##P<0.01；与多磺酸黏多糖乳膏治疗组比较：△P<0.05

表2 各组小鼠尾静脉血管内皮细胞E、p-selection表达比较

注：与空白组比较：**P<0.01；与模型组比较：#P<0.05，##P<0.01；与本组给药6 h后比较:△P<0.05

图1 各组小鼠尾静脉血管内皮细胞E-selection的表达(×400)

图2 各组小鼠尾静脉血管内皮细胞P-selection表达(×400)

组别ICAM-1VCAM-1给药6h后给药48h后给药6h后给药48h后空白组0.093±0.0230.124±0.0320.172±0.1210.217±0.116模型组0.279±0.071*0.728±0.254**△△0.213±0.1140.209±0.144护脉散高剂量预防组0.117±0.018#0.198±0.151护脉散高剂量治疗组0.321±0.136**##0.242±0.134

注：与空白组比较:*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较:#P<0.05,##P<0.01；与本组给药6 h后比较:△△P<0.01

图3 各组小鼠尾静脉血管内皮细胞ICAM-1表达(×400)

图4 各组小鼠尾静脉血管内皮细胞 VCAM-1表达(×400)

3 讨论

化疗性静脉炎发生的分子基础是炎性细胞与血管内皮之间黏附分子的相互作用[12]。Butcher和Springer提出了白细胞黏附级联的多步骤模式：E-/P-selectin在血管内皮表达介导白细胞沿血管壁滚动的最初黏附，随后ICAM-1、VCAM-1介导紧密黏附和内皮下迁移、渗出过程[13-14]。多项研究表明，VIN能增加血管内皮ICAM-1的表达，研究者推测这可能是其导致静脉炎发生的原因[15-17]。既往研究显示，护脉散既能有效缓解化疗性静脉炎患者临床症状[9]，又能有效预防化疗性静脉炎[10]，显示其疗效机制可能涉及ICAM-1及黏附级联的其他分子。本研究拟通过预防和治疗用药两种方式，分析黏附分子在VIN致化疗性静脉炎中的作用及护脉散的疗效机制。

本研究结果显示，护脉散能显著减轻静脉炎小鼠尾部炎性肿胀度且呈明显的量效关系，护脉散高、中剂量治疗组疗效优于多磺酸黏多糖乳膏治疗组。模型组给药6 h后，血管内皮细胞表面可见E-selectin大量表达，而P-selectin蛋白在给药前后各组小鼠均未见阳性表达，表明VIN致化疗性静脉炎的机制与其增加E-selectin表达有关，而似乎P-selectin未参与其致静脉炎的发生过程。护脉散预防组和治疗组小鼠尾静脉E-selectin表达量均较模型组明显降低，表明护脉散能明显抑制VIN导致的血管内皮细胞E-selectin的表达，减少炎性细胞对血管内皮细胞初始黏附，从而减轻后续的炎症反应，提示这是“护脉散”能有效预防VIN致化疗性静脉炎的原因之一。本研究表明，VIN能显著增加模型组小鼠尾静脉血管内皮细胞ICAM-1表达。本效应从给药后6 h起至给药后48 h持续加强，与既往研究一致[10-12]。护脉散治疗组ICAM-1表达量较模型组明显降低，揭示了“护脉散”能有效治疗化疗性静脉炎的疗效机制。而VCAM-1在给药前后各组小鼠中均未见阳性表达，表明VCAM-1蛋白并未参与VIN致化疗性静脉炎的过程。

根据化疗性静脉炎“红、肿、热、痛”的临床表现，本病属于中医“脉痹”范畴。《素问5四时刺逆从论》曰:“阳明有余病脉痹身时热”，提出“脉痹”病名及症状。林佩琴在《类症治裁》中云：“脉痹者，风湿郁热，经隧为壅”，而“热”“壅”分别道出静脉炎炎性反应和血栓形成的两大病理变化,彼则为风寒湿邪外侵，脉道气机不畅化而为热，化疗性静脉炎则为穿刺及药物内伤脉络，毒蕴为热。曾定伦据此提出“热壅血瘀”为化疗性静脉炎的中医病机，即静脉穿刺及药物毒性等原因导致脉络创伤，加之化疗细胞毒性药物损伤脉络，湿热毒邪外侵壅滞脉道，脉络阻塞不通，气血瘀滞，瘀血阻滞，血行不畅，不通则痛；气血运行不畅，血停为水，溢于脉外，津液输布受阻则肿胀；瘀血内蕴，蕴久化热则局部发热、发红。曾定伦以“清热解毒、消肿软坚、活血化瘀”立法，以古方 “保生救苦散”为基础制方。本方载于《兰室秘藏·疮疡门》，由生寒水石、大黄、黄连、黄柏组成，治疗“火烧或热油烙及脉痹脱肌肉者”，采用“上为细末，用油调涂之，或干用此药涂之，其痛立止，日近完复，永无破伤风之患”，提出针对病灶局部外用的方法，缩短起效时间，并大大减少并发症，改善局部病灶的预后。曾定伦易寒水石为芒硝，取黄芩代黄柏，加白芷创制“护脉散”局部外敷治疗本病。方中生大黄外用能凉血消肿、逐瘀通经，《本经》称其“主下瘀血，血闭，破症瘕积聚……推陈致新”。辅之以黄连、黄芩清热解毒、凉血泻火、消肿止痛；芒硝外用取其清热消肿之功，更重要的是芒硝有软坚散结之效，对于静脉炎发生过程中组织充血、肿胀及脉管壁条索状改变疗效显著。曾定伦将寒水石改为芒硝，并在该方中重用，加辛散通络止痛之白芷，迅速缓解静脉炎“肿、痛”症状，体现出老中医独特的临床思辨能力。

本研究结果表明，E-selectin和ICAM-1在血管内皮细胞上的阳性表达参与了长春瑞滨致化疗性静脉炎的发生，护脉散能明显降低上述2种黏附分子的表达，减轻炎性细胞对血管内皮的黏附、迁移、渗出，从而有效防治长春瑞滨致化疗性静脉炎。

[1] RAY-BARRUEL G, POLIT D F, MURFIELD J, et al. Infusion Phlebitis Assessment Scales: A Systematic Review of Their Use and Psychometric Adequacy[J]. Journal of the Association for Vascular Access, 2013, 18(4):217.

[2] TAGALAKIS V,KAHN SR,LIBMAN M,et al. The epidemiology of peripheral vein infusion thrombophlebitis:a critical review[J].Am J Med,2002,113(2):146-151.

[3] YOH K, NIHO S, GOTO K, et al. Randomized trial of drip infusion versus bolus injection of vinorelbine for the control of local venous toxicity[J]. Lung cancer, 2007, 55(3): 337-341.

[4] YOH K, NIHO S, GOTO K , et al. High body mass index correlates with increased risk of venous irritation by vinorelbine infusion[J]. Japanese journal of clinical oncology, 2004, 34(4): 206-209.

[5] 师佳佳, 刘立捷. 外周化疗性静脉炎的原因研究进展[J]. 护理研究: 下旬版, 2012, 26(12): 3361-3363.

[6] 冯莉霞, 王华庆, 贺瑾. 延胡索合剂预防和治疗肿瘤化疗性静脉炎的实验研究[J]. 中国肿瘤临床, 2012, 39(15): 1073-1076.

[7] HERTER J. ZARBOCK A. Integrin regulation during leukocyte recruitment[J]. The Journal of Immunology, 2013, 190(9): 4451-4457.

[8] 李玮, 孙晓明. 预防化疗性静脉炎的研究进展[J]. 肿瘤药学, 2012, 2(2): 90-92.

[9] 邱敏, 邹文娟, 陶劲, 等. 护脉散治疗化疗性静脉炎的疗效观察[J]. 中国药房, 2015, 26(29): 4092-4094.

[10] 邱敏, 应坚, 刘莉. 护脉膏预防化疗性静脉炎临床疗效观察[J]. 中医临床研究, 2014, 6(2): 29-31.

[11] 马丽娟, 王卓, 胡晋红. 西咪替丁对长春瑞滨所致输液性静脉炎的防治作用[J].药学服务与研究, 2009, 9(5): 340-343.

[12] 周秀敏, 朱丽杰, 张秀梅, 等. 中医药防治化疗性静脉炎的新进展[J]. 现代中西医结合杂志, 2013, 22(3): 338-340.

[13] BUTCHER E C. Leukocyte-endothelial cell recognition: three (or more) steps to specificity and diversity[J]. Cell, 1991, 67(6): 1033-1036.

[14] SPRINGER T A. Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm[J]. Cell, 1994, 76(2): 301-314.

[15] 陈桂园, 姜丽萍, 黄利全, 等. 静脉炎动物模型的建立及TNF-α, ICAM-1的表达[J]. 护理学杂志, 2014, 29(4): 6-9.

[16] 张敬, 洪月光, 翟鑫宏, 等. 中药芪柏制剂对化疗性静脉炎模型兔耳缘静脉血管内皮 ICAM-1 和 VEGF 表达的影响[J]. 河北中医药学报, 2010, 25(4): 5-8.

[17] 陈姣, 李平, 许珩. 黄连解毒膏外敷治疗长春瑞滨致兔静脉炎的研究[J]. 中医药临床杂志, 2012, 24(4): 323-326.

EffectofHuMaiPowderontheExpressionofE-selectinandICAM-1inVascularEndothelialCellsofMicewithPhlebitis

QIU Min1, Liu Li2Δ, ZOU Wen-juan1, SUN Ke1

(1.ChongqingHospitalofTraditionalChineseMedicine,Chongqing400021，China; 2.ExperimentalTeachingCenterofChongqingMedicalUniversity,Chongqing401331，China)

Objective:to study the effects of HuMai powder on expression of E-selectin and ICAM-1 in mouse vascular endothelial cells with infusion phlebitis.Methods:The phlebitis model of mice was established by injection of vinorelbine via tail vein．Different dose HuMai powder were used as two methods of prevention and treatment, compared by mucopolysaccharide polysulfate cream as a control drug, the degree of tail swelling was as effectiveness index in different mice groups. E-selectin, P-selectin, ICAM-1, VCAM-1 were also as observation index in mouse vascular endothelial cells. Results Different dose HuMai powder can effectively alleviate the inflammatory swelling of the tail of mice induced by vinorelbine, the effect was dose dependent. As compared with the blank group, Vinorelbine can increase the expression of E-selectin and ICAM-1 in mouse vascular endothelial cells in the model group. No positive expression of P-selectin and VCAM-1 were found in mouse vascular endothelial cells before and after drug administration. The expression levels of E-selectin and ICAM-1 in mouse vascular endothelial cells were significantly lower in high dose prevention group and treatment group than that of model group. Conclusion:The positive expression of E-selectin and ICAM-1 in vascular endothelial cells were involved in the occurrence of chemotherapy infusion phlebitis induced by Vinorelbine. HuMai powder could inhibit the expression of E-selectin and ICAM-1 in vascular endothelial cells caused by vinorelbine, thus effectively prevent and cure infusion phlebitis.

Infusion phlebitis; Vinorelbine; HuMai powder; Adhesion molecule; Vascular endothelial cells

R285.5

B

1006-3250(2017)09-1224-05

重庆市卫计委中医药科技项目(ZY201402041)；国家中医药管理局全国名老中医传承工作室建设项目[国中医药人教发〔2013〕47号]

邱 敏(1975-)，男，重庆市江津区人，副主任医师，医学博士，从事中西医结合恶性肿瘤的临床与研究。

刘 莉(1974-),女，重庆市铜梁县人，讲师，医学本科， Tel:18623106116，E-mail:1140641979@qq.com。

2017-02-20