野蔷薇根醇提物对大鼠动脉粥样硬化的影响❋

周红艳，李开言，黄 霞，孙 为，张 薇，王守富，李秋凤，陈阳春

(河南省中医药研究院中药研究所，郑州 450004)

【实验研究】

野蔷薇根醇提物对大鼠动脉粥样硬化的影响❋

周红艳，李开言△，黄 霞，孙 为，张 薇，王守富，李秋凤，陈阳春

(河南省中医药研究院中药研究所，郑州 450004)

目的：观察YT对大鼠AS的影响。方法：50只SD大鼠按随机数字表法分为空白组、模型组、YT低、高剂量组、AL组，灌胃给药90 d，每2周称摄食量和体质量，调整灌胃量；空白组喂标准饲料，其余组高脂饮食联合注射维生素D3并加免疫损伤造成AS；末次给药1h后，取主动脉进行病理组织学观察，比色法检测血清中SOD、MDA水平，化学发光法检测血清中CRP水平，ELISA法检测血清中sCD40L、ADNP、IL-18、IL-16水平，放射免疫分析法检测血清中IL-6、TNF-α水平。结果：YT低、高剂量组明显改善AS大鼠主动脉壁增厚、脂质沉积，减少泡沫细胞形成及淋巴细胞浸润；YT低剂量组体质量增加幅度、MDA水平显著降低，摄食量显著增加，YT高剂量组IL-18水平显著降低。结论：YT可通过调节脂质过氧化及炎症反应改善AS。

野蔷薇根醇提物；动脉粥样硬化；脂质过氧化；炎症反应

动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)是一种慢性血管炎症疾病，其血管内膜或功能受损导致通透性改变，血脂异常沉积到血管壁形成AS斑块。该病最早于儿童时期发生，潜伏期漫长，但后期往往急性加剧且危害极大，常见并发症如急性心肌梗死、不稳定型心绞痛、脑卒中等。研究发现，野蔷薇中含有大量具有降血糖、降血脂等生理功能的总皂苷、黄酮等[1-2]，醇沉淀物中含有增强机体免疫功能、降血脂等作用的多糖等[3-4]。前期临床研究发现，野蔷薇根具有降低总胆固醇、甘油三酯和ß-脂蛋白作用[5]。动物实验发现，野蔷薇根醇提物(简称YT)可减低高脂饲料喂养大鼠的血清和主动脉组织中胆固醇水平，通过调节脂质代谢、血钙水平和内皮功能紊乱来改善AS[6]。本研究应用高脂饮食联合注射维生素D3(vitamin D3, VitD3)[7]并加免疫损伤的方法复制大鼠AS模型，通过主动脉病理组织学观察YT改善AS的程度以及血清氧化应激、炎症相关指标水平的改变，进一步探讨YT改善AS的机制。

1 材料与方法

1.1 药物和试剂

YT，河南省中医药研究院中药所(原生药含量3.33 g/mL，批号20130322)；阿托伐他汀钙片(简称阿乐, AL)，北京嘉林药业股份有限公司(规格 10 mg/片，批号131107)；维生素D3注射液，上海通用药业股份有限公司(规格1 mL, 7.5 mg，30万U)，国药准字H31021404，产品批号121004);卵清白蛋白(Albumin Egg, AE),美国Sigma(规格100 g/瓶，产品批号326A053);完全弗氏佐剂(Freund’s Complete Adjuvant, FCA)(规格10 ml/瓶，产品批号107K8618)；白细胞介素18(Interleukin-18, IL-18)、白细胞介素16(Interleukin-16, IL-16)、脂联素(Adiponectin, ADNP)、可溶性CD40配体(Soluble CD40 Ligand, sCD40 L)、Elisa酶联免疫试剂盒，上海生工生物工程股份有限公司(批号20130624)；白细胞介素6(Interleukin-6, IL-6)、肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor, TNF-α)、放射免疫试剂盒，北京普尔伟业生物科技有限公司(批号20130625)。

1.2 动物及饲料

雄性SPF级SD大鼠50只，体质量(80±20) g，购自河南省实验动物中心(许可证号SCXK(豫)2010-0002, No.41003100000747)。高脂饲料配方：2% 胆固醇，10% 猪油，5% 白糖，0.3% 胆酸钠，5% 蛋黄粉，0.2% 丙基硫氧嘧啶，77.5% 标准饲料。

1.3 大鼠AS模型的制备

大鼠50只，按随机数字表法分为空白组、模型对照组(蒸馏水10 mL/kg)、YT低剂量组(4.15 g/kg)、YT高剂量组(8.30 g/kg)和AL组(2.0 mg/kg)，灌胃给药90 d。每2周称大鼠摄食量和体质量，调整灌胃量；参照文献[6-8]改良对SD大鼠进行AS造模。除空白组外，其余各组给予高脂喂养，并于第15、45、75天腹腔注射(ip)60万U/kg、10万U/kg、10万U/kg的VitD3。第16天取1 mL含3 mg/kg AE的抗原乳剂对大鼠背部皮下多点注射进行免疫损伤。第46、61、76天对大鼠均ip 1 mL AE溶液(2.5 mg/kg)激发免疫反应，从而复制大鼠AS模型。

1.4 指标检测

末次给药1 h后，大鼠均以10%水合氯醛0.3 ml/100 g麻醉，腹主动脉取血分离血清。迅速解剖大鼠，摘取主动脉组织，常规固定、脱水、切片、HE染色，进行病理组织学观察。比色法检测血清超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase, SOD)、丙二醛(Malondialdehyde, MDA)水平，发光法检测C反应蛋白(C-reactive protein, CRP)，ELISA法检测血清IL-18、IL-16、sCD40 L、ADNP，放免法检测血清IL-6、TNF-α。

1.5 统计学方法

采用SPSS.16.0软件进行统计分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 YT对AS大鼠体质量和摄食量的影响

表1、2显示，在实验的90 d期间，空白组大鼠体质量随实验时间延长逐步增加。模型各组大鼠体质量也有增加，但增加幅度明显低于空白组，并差异有统计学意义(P<0.05)，与模型组比较，YT低剂量组与AL组体质量增加幅度明显降低(P<0.05)；各组大鼠摄食量结果比较表明，模型各组大鼠比空白组大鼠摄食量显著减少，差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 各组大鼠实验90 d体质量经时变化比较

注：与空白对照组比较：※P<0.05；与模型对照组比较：△P<0.05

表2 各组大鼠实验90 d摄食量比较

注：与空白对照组比较:※P<0.05；与模型对照组比较：△P<0.05

2.2 YT对AS大鼠血清SOD、MDA的影响

表3显示，与空白组比较模型组大鼠血清SOD检测值下降，但差异无统计学意义，MDA值升高具有显著意义(P<0.05)；YT低剂量组、AL组均降低模型组MDA水平，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.3 YT对AS大鼠血清炎性因子的影响

表4显示，模型组血清TNF-α、IL-6 均显著高于空白组(P<0.05)，各药物干预组虽有降低血清TNF-α、IL-6水平的趋势，但差异无统计学意义。模型组CPR含量显著高于空白组(P<0.05)，而各药物干预组与模型组比较差异无统计学意义。ELISA法检测各组血清IL-16、IL-18、sCD40 L水平，结果显示模型组检测值均高于空白组，其中IL-18、sCD40 L比较差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，各给药组IL-18均值降低，与YT高剂量组比较差异有统计学意义(P<0.05)；各给药组sCD40 L均值也降低，AL组差异有统计学意义(P<0.05)；模型组大鼠血清ADPN水平显著低于空白组(P<0.05)。与模型组比较，YT干预组具有升高血清ADPN趋势，AL组可显著提高血清ADPN水平，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.4 大鼠主动脉病理形态学观察结果

图1 各组大鼠主动脉病理变化比较

图1显示，空白对照组主动脉壁的内膜、中膜、外膜三层结构正常，内膜光滑，内皮完整，中膜弹力纤维呈环形排列，内皮下、肌层及外膜均未见病变。模型组主动脉壁的三层结构尚可，但内膜明显增厚、局部隆起或伴损伤，内皮下有粥样物质沉积，结构稍紊乱，可见泡沫细胞和结晶体形成，并有淋巴细胞或巨噬细胞浸润。病变区的肌层受压萎缩、变薄，弹力纤维结构不清，外膜无明显异常。YT低剂量组内膜偶见细胞间物质沉积，其他无异常。YT高剂量组内膜增厚，出现局灶性损伤，肌层完好，其他正常。AL组主动脉基本光滑平坦，未见明显病变。

表3 各组大鼠血清SOD、MDA比较

注：与空白对照组比较：※P<0.05；与模型对照组比较：△P<0.05

3 讨论

野蔷薇(Rosa multiflora Thunb)别称白残花、多花蔷薇、刺花，果实名营实，花名刺莉花，花、果、根、茎都供药用。野蔷薇根苦、涩、寒、无毒，归脾、胃、肾经，最早收载于《名医别录》，具有清热解毒、祛风除湿、活血调经、固精缩尿之功效。梁坤等[8]发现，刺玫蔷薇茎醇提物具有抗氧化、抗衰老、治疗心脑血管疾病、抗菌消炎等多种生理功能。焦淑萍等[9]发现，野蔷薇果可显著降低高脂大鼠血清TC、TG内皮素(ET)含量(P<0.01)，并明显提高HDL-C、NO含量(P<0.01)。王玲等[10]研究报道，野蔷薇各部位醇提物中总黄酮含量丰富，尤其根皮中含量最高，故研究野蔷薇根醇提物对动脉粥样硬化的影响对扩大药源具有重要意义。

表4 各组大鼠血清炎性因子水平比较

注：与空白对照组比较:※P<0.05；与模型对照组比较：△P<0.05

氧化应激存在于AS整个发展过程中[11]。脂质过氧化能够直接损伤血管内皮细胞或氧化修饰低密度脂蛋白，形成氧化型低密度脂蛋白，进入血管壁内皮下间隙，被单核细胞、巨噬细胞识别和吞噬，致使内皮细胞蜕变，形成泡沫细胞，成为AS病变的基础或加重AS斑块的形成[12]。SOD是体内清除氧自由基的主要抗氧化酶之一，MDA 是脂氢过氧化物的分解产物之一，其含量可反映体内脂质过氧化的程度，是脂质过氧化也是细胞氧化损伤的一个重要检测指标。表3显示，野蔷薇根醇提物不能提高 SOD活力，但可以显著降低MDA含量，提示该药可能通过减少脂质过氧化物的产生发挥抗氧化的作用。

美国学者Ross提出“AS是一种炎症性疾病”[13]，促炎与抗炎因子平衡失调成为AS研究的热点。AS炎症反应与痰、瘀、毒的联系日益受到重视，胡世云等[14]提出AS炎症反应与中医学感受外来邪毒和内生邪毒理论正好吻合。痰瘀阻络是AS的基本病理变化，虚、瘀、毒相互交结，共同影响着AS的发生发展及转归。在AS的发生发展过程中，多种细胞(如单核巨噬细胞、内皮细胞等)分泌大量炎性因子，如 CRP[15]、TNF-α、IL-6[16]、IL-18[17-19]、sCD40L[20-22]等。炎性因子主要通过损伤内皮、诱导单核细胞与内皮黏附及向内膜下迁移等环节促进AS形成，并可通过促进细胞外基质降解和抑制其修复，增加斑块的不稳定性[23]。ADPN可抑制巨噬细胞对胆固醇酯的摄取，减少单核巨噬细胞分泌TNF-α，抑制其介导的炎症反应[23]，直接影响AS的发生发展。表4、5显示，YT可显著减低AS大鼠血清炎性因子IL-18水平，与模型对照组比较具有显著意义，也可不同程度地降低AS大鼠血清TNF-α、IL-6、CRP、sCD40 L含量，升高抗炎因子ADPN含量，表明YT可通过调节促炎与抗炎因子平衡影响AS。

综上，YT对于大鼠AS 的发生发展具有一定的干预作用，其作用环节可能与减少氧化损伤、调节促炎与抗炎因子平衡有关。

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EffectsofEthanolExtractofRosaRosaonAtherosclerosisinRats

ZHOU Hong-yan, LI Kai-yan△, Huang Xia, Sun Wei, Zhang Wei, Wang Shou-fu, Li Qiu-feng, Chen Yang-chun

(HenanProvinceChinesemedicineresearchinstitute,InstituteofChineseMedicine,Zhengzhou450004,China)

Objective:To observe the influence of alcohol extraction of Rosa multiflora Thunb on atherosclerosis rats. Methods:Fifty uniform weight SD rats were randomly divided into 5 groups, including blank control group, model group, Rosa multiflora Thunb extract low and high group, atorvastatin calcium tablet group; Intragastric administration for 90 days and gastric volume was adjusted with food ration and weight every two weeks; Rats in blank control group were fed with standard diet, rats in other groups were fed with high-fat diet, intraperitoneally injected vitamin D3 and dealed with immune injury. One hour after the last delivery, take the rat aorta to observe the pathological tissue. The level of superoxide dismutase and malondialdehyde was detected by colorimetric method. The level of C-reactive was detected by chemiluminescence. The level of soluble CD40L, Adiponectin, Interleukin-18, Interleukin-16 was detected by enzyme-linked immunosorbent assay. The level of Interleukin-6 and Tumor necrosis factor-α was detected by radioimmunoassay. Results:The incrassate aortic wall and lipidosis could be improved obviously by alcohol extraction of Rosa multiflora Thunb of low and high dose group, also foam cell formation in artery endothelium and lymphocytes infiltration could be decreased. The rats in YT low dose group showed remarkablely decreased weight gain and malondialdehyde, meanwhile increased food ration. The rats in YT high dose group showed remarkablely decreased interleukin-18. Conclusions:Rosa multiflora Thun extract could improve AS through regulating lipid peroxidation and inflammatory reaction.

Rosa multiflora Thunb extract; atherosclerosis; lipid peroxidation; inflammatory reaction

R285.5

B

1006-3250(2017)09-1220-04

河南省公益预研项目(1603582)-野蔷薇根总黄酮的提取、纯化及抗动脉粥样硬化药理活性研究；国家中医药管理局全国名老中医药专家传承工作室建设项目[国中医药人教发(2012)149号]

周红艳(1973-)，女，江苏铜山人，高级实验师，医学硕士，从事中西医结合基础和中药药理学研究。

李开言(1986-)，女，河南驻马店人，研究实习员，医学硕士，从事中药药理和分子生物学研究，Tel:13849187713,E-mail：likaiyan_0917_2006@126.com。

2017-04-09