基于SNAP-25表达的肾虚质大鼠突触可塑性实验研究❋

孙理军，孙耀光，孙瑜嬬，张 琪，刘熙如，柏云飞

(陕西中医药大学，陕西 咸阳 712046)

【实验研究】

基于SNAP-25表达的肾虚质大鼠突触可塑性实验研究❋

孙理军，孙耀光，孙瑜嬬，张 琪，刘熙如，柏云飞

(陕西中医药大学，陕西 咸阳 712046)

目的：通过大鼠海马突触相关蛋白-25(SNAP-25)的表达，揭示肾虚质致突触可塑性降低的分子生物学机制。方法：通过“猫吓鼠”造模法恐吓受孕母鼠，待产子后继续恐吓仔鼠，从而建立先天不足、后天失养复合型肾虚质仔鼠模型。补肾药物左、右归丸治疗3个月后，Morris水迷宫检测仔鼠学习记忆能力，ELISA法测定海马单胺类神经递质去甲肾上腺素(NE)含量，免疫组化法检测SNAP-25蛋白表达。结果：Morris水迷宫：模型组潜伏期、总路程、首次穿越目标区时间较空白组长，左、右归丸组较模型组改善；NE含量：模型组较空白组降低，左、右归丸组较模型组升高；SNAP-25表达，模型组较空白组降低，左、右归丸组较模型组上调。结论：肾虚质仔鼠突触可塑性能力减退与SNAP-25表达相关，补肾药物左、右归丸具有改善和提高作用。

肾虚质；SNAP-25；突出可塑性

肾虚体质以肾中精气虚损、脏腑机能低下为主要特征，是临床常见的体质类型之一。中医理论认为“肾藏志”(《素问·宣明五气》)、肾“在志为恐”(《素问·阴阳应象大论》)、“肾虚则智不足”(《医学新悟》)，惊恐可致肾精亏虚、学习记忆能力减退。大量研究表明[1-4]，学习记忆能力的获取与巩固与突触可塑性相关。SNAP-25是突触前膜蛋白，参与神经递质的调节与释放、囊泡与细胞膜的融合对接，并具有选择性剪接异构体的能力，是构成及改变突触可塑性的关键蛋白。本实验选取SNAP-25作为研究目标，从而探讨肾虚质与突触可塑性能力降低的相关性。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级12周龄SD大鼠雄性5只，雌性10只(体质量300～350 g)，购于西安第四军医大学实验动物研究中心(生产许可证SCXK(陕)2014-001)，标准饲料进食及饮水、室温喂养。3月龄雄性土猫1只鲜活小鼠喂养。

1.2 实验材料

左归丸(河南宛西制药股份有限公司，国药准字Z41020696)、右归丸(河南宛西制药股份有限公司，国药准字Z41022170)；Morris水迷宫(中国医学科学院药物研究所)；大鼠NE ELISA试剂盒(南京建成生物工程研究所)；SABC免疫组化SNAP-25兔抗试剂盒、生物素化羊抗兔二抗、DBA显色试剂盒、PBS磷酸盐缓冲液(均购自博士德生物)；OCT包埋剂、水合氯醛、多聚甲醛、液氮(均购自勇毅试剂公司)；电子天平、高速匀浆器(XHF-D)、酶标仪(美国Molecular Devices公司SpectraMax5)、冰冻切片机、显微镜、特质鼠笼、猫笼等。

2 方法

2.1 分组与造模[5]

大鼠适应性饲养1周，10只雌鼠随机分成恐吓组6只、正常组4只，分别与雄鼠合笼交配。成功受孕后恐吓组孕鼠置于特质鼠笼，每日早9∶00至晚21∶00于猫笼旁被恐吓，同时在猫笼内放置鲜活小鼠令其捕食，使孕鼠在旁观望并处于恐慌状态直至产子；正常组孕鼠不予恐吓自然分娩。待2组所产仔鼠4周龄时，将正常组孕鼠所产仔鼠随机8只作为空白组，将恐吓组母鼠所产仔鼠随机24只分为肾虚质组、肾虚质左归丸干预组(以下简称“左归丸组”)、肾虚质右归丸干预组(以下简称“右归丸组”)，每组各8只，继对此3组仔鼠继续进行土猫恐吓，持续4周。

2.2 给药及计量

按文献折算[6]，大鼠用药量约为成人的6.25倍。左归丸成人服生药量18 g/d，则大鼠生药量为1.875 g/kg/d，蒸馏水配置成1.875 g/mL混悬液备用。右归丸成人服生药量9 g/d，则大鼠生药量为0.9 375 g/kg/d，蒸馏水配制成0.9 375 g/mL混悬液备用。对仔鼠恐吓同时开始灌胃，药物组给予制备好的混悬液，空白组给予等量生理盐水10 mL/kg/d，每日1次，每周用药5 d停2 d，连续3个月。

2.3 水迷宫训练

图1 各组仔鼠游动搜索策略统计结果(单位：次)

各组仔鼠8周龄时进行Morris水迷宫训练，历时7 d，每日下午15∶00进行。第1天仔鼠自由游动120 s适应环境；第2～6天学习训练：仔鼠在水中寻找平台并停留15 s；若120 s 后仍未找到平台则引导登台并停留15 s；训练完成后迅速将小鼠擦干放回鼠笼；每日训练4次，每次间隔30 min。第7天测试，检测并记录各组仔鼠4次游泳的平均路程(cm)、潜伏期(s)、首次穿越目标区时间(s)。

2.4 神经递质含量测定

末次给药1 h后断头处死，冰上迅速剥离海马，4 ℃生理盐水冲洗、滤纸吸干水分，称重后置液氮冻存。制备10%海马组织匀浆，3000 r/min 离心5 min取上清，参照ELISA试剂说明书，酶标仪450 nm处测定NE含量。

2.5 免疫组化检测

末次灌胃结束后禁食12 h称重，7%水合氯醛腹腔麻醉(0.5 ml/100 g)，4%多聚甲醛灌注固定，冰上取海马PBS冲洗5 min×5次，30%蔗糖溶液4 ℃冰箱脱水过夜PBS冲洗5 min×5次，OCT包埋、过液氮，冰冻切片(切片厚度为30 μm)室温静置1 h；切片置入甲醇新鲜配置0.3%双氧水室温封闭20 min， PBS冲洗5 min×3次；滴加5%BSA封闭液，室温避光孵育30 min；弃液滴加稀释的一抗4 ℃冰箱过夜，次日取出复温后PBS冲洗5 min×5次；滴加二抗，室温孵育2 h， PBS冲洗5 min×3次；避光滴加DAB显色，室温避光显色30 min，PBS冲洗5 min×3次，梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片，干燥后光镜下拍照。

2.6 统计学方法

3 结果

3.1 仔鼠学习记忆能力变化

表1显示,潜伏期、总路程、首次穿越目标区时间方面，肾虚质组长于空白组和左、右归丸组(P<0.01)；与肾虚质组比较，左、右归丸组潜伏期、总路程、首次穿越目标区时间降低(P<0.01)；左、右归丸2组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 各组仔鼠Morris水迷宫参数比较

注：与空白组比较:△P<0.05,△△P<0.01；与肾虚质组比较:*P<0.05,**P<0.01

图1显示，游动搜索策略统计结果显示，肾虚质组随机性搜索策略远高于空白组、左归丸组和右归丸组，提示肾虚质仔鼠游动时目标性不明确，常出现无目的徘徊；而在目的明确、方向定位较高级的边缘性、直线性、趋向性搜索策略中，肾虚质组均低于其余3组。

3.2 海马NE含量与SNAP-25表达变化

表2显示，NE含量肾虚质组较空白组下降(P<0.05)，左、右归丸组较肾虚质组升高(P<0.05)，左、右组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。分析比较各组仔鼠海马区SNAP-25光密度值发现，肾虚质组表达低于空白组和左、右归丸组(P<0.01)，空白组略高于左、右归丸组，但3组间比较差异不明显(P>0.05)。

图2显示，光镜下观察，空白组仔鼠海马锥体层神经元细胞数目多，免疫组化染色深，细胞排列整齐、紧密；肾虚质组神经元细胞数目减少，细胞染色浅，细胞排列疏松、紊乱，细胞间隙增大；左归丸组与右归丸组神经元细胞较肾虚质组数目增多，染色较深，细胞变化趋于空白组。

表2 各组仔鼠NE含量与SNAP-25表达比较

注：与空白组比较:△P<0.05，△△P<0.01；与肾虚质组比较:*P<0.05，**P<0.01

图2 各组仔鼠SNAP-25蛋白表达(免疫组化染色 ×200)

4 讨论

学习和记忆过程由大脑控制完成，以神经元间的信息传导为基础，以突触的可塑性为表现形式。突触的可塑性已被公认为是构成学习与记忆的重要神经化学基础，而不断地学习和记忆行为又可形成新的神经回路，从而反向增强突触的可塑性。通过对大鼠进行水迷宫学习记忆训练，使其海马内突触数量、突触小泡数量或体积增加、突触活性区膜面积增大等一系列形态化学变化，构建加强其脑内神经突触的可塑性及大脑皮层的发达度。

肾藏精、精生髓、脑由髓聚，故脑髓的生成与发育依赖于肾中精气的充盈[7]，只有保证脑有所养、元神精湛，才能学习不止、记忆不怠。临床上，学习记忆能力的减退是肾虚质的主要表现，也是中医肾藏志理论的重要体现[8]。本实验基于肾虚体质的生理病理特点，结合大量实验研究，以中医“肾藏志、在志为恐”为理论指导，从分子机制角度探究肾虚质与突触可塑性的相关性。

SNAP-25(Synaptosomal-associated protein 25 kDa)作为突触相关蛋白，参与组成神经突触囊泡，与树突、轴突、突触小体的发育密切相关[9-11]。同时，SNAP-25还可通过提高突触小泡蛋白与突触融合蛋白间的亲和力，增强突触末梢神经递质的释放能力[12-15]，从而进一步加强突触的可塑性，提高学习记忆能力。单胺类神经递质NE对学习记忆具有维持作用，能增强脑内突触的传入，从而促进信息的存储和再现，因此脑内NE含量的变化可直观反映出学习记忆物质基础的改变。

实验结果显示，Morris水迷宫训练中，肾虚质大鼠潜伏期、总路程、首次穿越目标区时间较其他各组延长滞后，较其他各组游动缓慢，常出现无目的的徘徊游动，甚者120 s内无法完成登录水中平台任务；游动搜索策略统计结果显示，肾虚质组更倾向采用随机性搜索，而空白组及左、右归丸组则较多采用目的明确、方向定位较高级的直线型、边缘性、趋向性搜索策略。同时，肾虚质组脑NE含量较正常组降低，脑海马SNAP-25含量亦显著低于其他各组。通过补肾药物左、右归丸干预治疗后，肾虚质仔鼠学习记忆能力明显上调，脑内NE含量与SNAP-25表达均有所增加。实验结果证明，肾虚质造成突触可塑性表达降低的分子机制与脑内SNAP-25的含量变化密切相关；补肾药物具有改善和提高的作用，且2种补肾药物效果平齐，均对肾虚体质具有正面调节作用，进一步说明肾虚质主要表现为肾精虚的生理状态。

此次实验证明，先天不足、后天失养的复合型肾虚质模型符合中医情志致病的病因学原理和中医肾藏象理论，具有操作的可行性，同时为肾虚体质差异性的生物学基础提供了实验依据，且为临床干预亚健康状态的形成以及临床治疗记忆行为能力障碍性疾病，尤其是老年性疾病的发生提供了科学有效的理论依据。

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ExperimentalStudyonSynapticPlasticityinRatswithKidneyDeficiencyBasedonSNAP-25expression

SUN Li-jun, SUN Yao-guang, SUN Yu-ru, ZHANG Qi, LIU Xi-ru, BAI Yun-fei

(ShaanxiUniversityofTCM,Shaani,Xianyang712046,China)

Object: Through the experimental study about expression of hippocampal synapse associatec protein-25 of rats with kidney-deficiency constitution, to discuss the molecular biology mechanism of decreased synaptic plasticity due to kidney-deficiency constitution. Method: Used the way of “cat scare rat” to scare pregnat rats. After they gave birth to a child, their offsprings got on being scared to built composite ratesl with deficiency and acquired dystrophy. Then kidney reinforcing drugs gave treatment for 3 months, Morris water maze tested offsprings’ study and learning capacity and immunohistochemical method tested their expression of SNAP-25.Results: Morris water maze test: The incubation period, total distance and the first time through target area of model group were longer than blank group, while in ZuoGui pill and YouGui pill groups, these indexes were better than model group;The change of neurotransmitter NE content: Compared with the blank group, the NE content in model group was reduced. Compared with the model group, the NE content in ZuoGui pill and YouGui pill group was increased;Expression of SNAP-25: The expression in model group decreased than blank group; but compared with model group, it increased when kidney reinforcing drugs was given.Conclusion: The decreased synaptic plasticity is related with the expression of SNAP-25, and it can be improved by the kidney reinforcing drugs.

Kidney-deficiency constitution; SNAP-25; Synaptic plasticity

R285.5

B

1006-3250(2017)09-1217-03

陕西省重点实验室研究项目(15JS026)-基于肾藏志理论的肾虚体质大鼠海马区学习记忆蛋白Caveolin-1表达的研究

孙理军(1961-)，女，陕西咸阳人，教授，医学硕士，硕士研究生导师，从事中医体质理论的实验及临床应用研究。

2017-03-19