硫磺熏蒸知母的化学标志物分析

郑伟 王芳旭 孙欣光 康利平 赵阳 张洁 马百平

[摘要]中药知母经硫磺熏蒸制备成含硫知母饮片，利用UPLCQTOFMSE结合UNIFI数据分析平台、主成分分析法（PCA）及正交偏最小二乘判别分析（OPLSDA），分析并在线鉴定了硫磺熏蒸前后知母饮片中的16个主要的差异性成分，其中9个主要存在于熏蒸后知母饮片中；确定了熏蒸后知母饮片中的化学标志物，为硫熏后新产生的亚硫酸酯化衍生物。同时利用UPLCQTOFMSE寻找主要化学标志物——知母皂苷BⅡ亚硫酸酯（m/z 983）的手段，建立了知母饮片硫磺熏蒸的快速筛查方法，该方法便捷准确，可作为知母质量控制的有效辅助手段。这是首次分析鉴定了甾体皂苷类成分的亚硫酸酯化衍生物，并应用这一方法筛查硫磺熏蒸的知母饮片。

[关键词]知母； 硫磺熏蒸； UPLCQTOFMSE； 化学标志物

Analysis of chemical markers in sulfurfumigated Anemarrhenae Rhizoma

ZHENG Wei1，2， WANG Fangxu2， SUN Xinguang2， KANG Liping2，3， ZHAO Yang2， ZHANG Jie2， MA Baiping2*

（1. Tianjin University of Traditional Chinese Medicine， Tianjin 300193， China；

2. Institute of Radiation Medicine， Academy of Military Medical Sciences， Beijing 100850， China；

3. National Resource Center for Chinese Materia Medica， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China）

[Abstract]Sulfurcontaining Anemarrhenae Rhizoma decoction pieces were prepared by using sulfurfumigating procedure The difference components before and after sulfur fumigation in Anemarrhenae Rhizoma were analyzed and online identified by UPLCQTOFMSE combined with UNIFI informatics platform， principal component analysis （PCA） and orthogonal partial least squares discriminant analysis （OPLSDA） respectively As a result， 16 major differences components were identified， and among them， 9 components were mainly from sulfurfumigated samples The main chemical markers in sulfurfumigated Anemarrhenae Rhizoma were identified as the sulfite derivatives newly produced after sulfurfumigating Meanwhile， UPLCQTOFMSE was used to find the main chemical marker anemarrhena saponin BⅡ sulfite （m/z 983） By using this method， a rapid screening method for sulfurfumigated Anemarrhenae Rhizoma was established This was a convenient and accurate detection method for sulfur dioxide residue， and it can be used as an effective assistant method to control the quality of Anemarrhenae Rhizoma At the same time， it was the first time to identify sulfited derivatives of steroidal saponins， and screen the sulfurfumigated Anemarrhenae Rhizoma

[Key words]Anemarrhenae Rhizoma； sulfurfumigated； UPLCQTOFMSE； chemical markers

中藥知母为百合科多年生草本植物知母Anemarrhena asphodeloides Bge的干燥根茎，具有清热泻火、滋阴润燥等功效[1]。知母中主要化学成分为甾体皂苷、黄酮、多糖等类型，其中根茎中总多糖含量高达30%[2]。由于其含有较高的多糖成分，新鲜知母药材容易发霉变质，对其药材的储存一直是一个值得关注的问题。

硫熏法是部分中药材传统加工养护方法之一，具有防虫、防霉、杀菌和美化药材外观的作用[3]，因其价格低廉、操作方便仍被应用于知母鲜药材的前期加工中，近年来甚至被滥用[4]。研究表明硫磺熏蒸处理可导致部分药材活性成分发生转化[56]，甚至造成SO2或亚硫酸盐残留量过高，不但影响药材质量，而且存在安全隐患[79]。为了监控药材硫熏情况，2015年版《中国药典》附录收载了中药材及饮片中SO2残留量测定方法[1]。然而有研究显示， 二氧化硫会随着药材贮藏时间的延长不断逸失[10]。因此，寻找并确定硫熏药材的化学标志物变得尤为重要。endprint

超高效液相色谱四极杆飞行时间质谱（UPLCQTOFMSE）技术具有高分辨和良好的结构鉴定功能，作为中药材化学成分快速鉴定的手段，已广泛用于中药材化学成分的表征及快速鉴定[11]，结合主成分分析（PCA）技术，可使中药材及复方的质量控制等研究更加便捷简单[12]。

本论文应用UPLCQTOFMSE结合主成分分析（PCA）及正交偏最小二乘判别分析（OPLSDA）对硫磺熏蒸前后的知母饮片进行对比分析，观察硫磺熏蒸对知母饮片化学成分的影响并鉴定其差异性成分，确定了硫磺熏蒸知母的标志性成分，旨在为知母药材的储藏以及质量控制方法和相关监管法规的制定提供科学依据。

1材料

11仪器与试剂Waters ACQUITYTM超高效液相色谱系统（Waters公司，Milford，MA，美国）；SYNAPT G2质谱系统（Waters 公司，Manchester，英国）；UNIFI 181软件、Umetrics EZinfo 30 软件（Waters 公司，Manchester，英国）；色谱柱：Acquity HSS T3 C18（21 mm×100 mm，18 μm，Waters，爱尔兰）；Sartorius BP211D 1/10万电子天平（Sartorius公司，美国）；舒美KQ600E数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，江苏）；SPE 固相萃取柱为Cleanert ODS C18（1 000 g·6 L-1，Agela，天津）；022 μm 微孔滤膜（上海兴亚净化材料厂）。甲醇、乙腈（色谱纯，Fisher，美国）；甲酸（色谱纯，Acros Co Ltd，NJ，美国）；屈臣氏蒸馏水（广州屈臣氏蒸馏水有限公司）。其他试剂均为市售分析纯。

12药材11批知母药材及饮片样品，其中3批鲜知母药材（1～3）于2016年11月分别采自河北安国不同种植区域，5批未经硫熏知母饮片及3批硫熏知母饮片分别收集自河北安国药材市场。所用样本均由中国医学科学院&北京协和医学院药用植物研究所郭宝林研究员鉴定为百合科植物知母A asphodeloides的根茎及其饮片。

2方法

21硫磺熏蒸知母药材的制备将3批鲜知母根茎切片，阴干。全部8批未经硫磺熏蒸处理知母饮片各取100 g，用10 mL水浸润05 h。硫磺熏蒸过程在真空干燥器中进行，将10 g硫磺点燃灼烧至熔融发烟，转移至干燥器底部，取知母饮片放入干燥器上层，以凡士林涂抹盖口密闭容器，同时打开抽气阀门，待硫磺燃尽立刻关闭抽气阀门，硫熏6 h后，续加5 g硫磺点燃熏蒸10 h，后取出待用。

22供试品溶液制备8批未熏蒸知母饮片及11批熏蒸知母饮片样品（编号1～19）分别粉碎后过40 目筛，各精密称取药材粉末10 g，置于具塞三角瓶中，分别加入体积分数为70%乙醇40 mL，浸泡30 min 后超声处理（功率250 W，频率40 kHz）30 min，冷却后经定量滤纸滤过，滤液经SPE 固相萃取柱萃取，再经体积分数为80%乙腈洗脱至50 mL量瓶中并定容，经022 μm 微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

23混合對照品溶液配制由于螺甾皂苷在甲醇水系统较易溶解，而呋甾皂苷在甲醇水系统易甲氧基化[13]，在乙腈水系统中完全溶解，故将呋甾皂苷溶解于乙腈水系统；其他类型化合物溶解于甲醇水系统。精密称取芒果苷、知母皂苷BⅡ、知母皂苷B及知母皂苷AⅢ各03 mg，知母皂苷BⅡ溶解于1 mL 30%乙腈，芒果苷溶解于1 mL 50%甲醇，知母皂苷B及知母皂苷AⅢ分别溶解于1 mL甲醇，制得各对照品储备液。再分别取各对照品储备液200 μL，混匀既得。

24色谱条件色谱柱：Waters ACQUITYTM UPLC HSS T3 色谱柱（21 mm×100 mm，18 μm）；流动相：01%甲酸水溶液（A）乙腈（B）；梯度洗脱（0～05 min，5% B；05～30 min，5%～15% B；30～60 min，15%～20% B；60～100 min，20%～22% B；100～135 min，22% B；135～175 min，22%～38% B；175～210 min，38%～50% B；210～220 min，50% B；220～235 min，50%～85% B；235～256 min，85% B）；流速06 mL·min-1；柱温45 ℃；进样量1 μL。

25质谱条件电喷雾电离离子源（ESI），离子化模式分为正、负离子，离子源温度为100 ℃，脱溶剂气体为氮气，流速850 L·h-1，温度为450 ℃。毛细管电压为3 000 V，锥孔电压为30 V，扫描范围m/z 100～1 500。低能量扫描时trap 电压为6 eV，transfer 电压为4 eV；高能量扫描时，负离子模式：trap 电压为40～60 eV，transfer 电压为15 eV，正离子模式：trap 电压为50～65 eV，transfer 电压为15 eV。准确质量数用Leucineenk Ephalin 作校正液。

26UNIFI数据库及分析方法的建立应用UNIFI 181软件的数据库管理系统， 补充软件自带中药数据库中知母药材的化学成分及相关信息，并导入UNIFI软件， 构建知母化学成分专属数据库。分析方法设置中设定3D 峰检测参数的强度阈值 （高能量为30计数， 低能量为200计数），加合离子峰的种类 （负离子模式为[M-H]-，[M+HCOO]-，正离子模式为[M+H]+，[M+Na]+）。

3结果

31非硫磺熏蒸知母与硫磺熏蒸知母化学成分对比分析采用所建立的UPLCQTOFMSE方法快速分析1批实验室硫磺熏蒸知母及3批市场收集的硫磺熏蒸知母，所得色谱图见图1，发现实验室熏蒸知母与市场收集的熏蒸知母化学成分类似，可见实验室硫熏方法可模拟产地硫熏干燥方法。endprint

采用所建立的UPLCQTOFMSE方法快速分析非硫磺熏蒸知母及实验室硫磺熏蒸知母，并对8组相对应的硫磺熏蒸知母及非硫磺熏蒸知母进行PCA 分析，所得PCA 得分图见图2。二维PCA得分图表明，硫熏知母与非硫熏知母化学成分差异较大。为了进一步探寻区分硫磺熏蒸对知母的影响，采用正交偏最小二乘判别分析（OPLSDA）进行处理，得到SPlot 图，见图3。选择离散程度较大的点，即VIP 值大于25 的点进行分析，这些点代表对两者差异贡献较大的成分，最终确定16个差异性成分（其中硫熏知母中9个，5个为新生成的含硫衍生物，非硫磺熏蒸知母中7个差异性成分），见表1。硫熏知母与非硫熏知母之间主要差异性成分为甾体皂苷类，并且硫磺熏蒸不但会导致药材产生一定的含硫衍生物，同时也会引起药材中化合物含量的变化。

快速分析非硫磺熏蒸知母及硫磺熏蒸知母，样品BPI 色谱图见图4。将采集的Continuum的数据导入到UNIFI软件中，软件自动标识经处理后的可信数据， 给出保留时间、化學式、质量数误差、同位素匹配偏差， 标识的高能量碎片数目等信息。根据保留时间及相关文献确证，即可确定相应的色谱峰。

非硫磺熏蒸知母与硫磺熏蒸知母的16个差异性成分在负离子模式易产生[M-H]-加合离子峰，利用UNIFI 181软件中的“Elemental Composition”计算工具，确定各色谱峰对应化合物的可能分子式。分子式确定为C45H76O19的色谱峰有9～11，根据与对照品保留时间相比较，确定色谱峰9为知母皂苷BⅡ。峰10，11裂解碎片与峰9一致，判断其为知母皂苷BⅡ的异构体，根据保留时间，及相关文献比对[14]，确定色谱峰10为25R知母皂苷BⅡ，色谱峰11为25R，SofficinalisninⅠ。

分子式确定为C45H76O21S的色谱峰有5，6，色谱峰5在低能量负离子给出m/z 983454 5[M-H]-，负离子高能量给出m/z 821400 6，757441 7，595387 8和433333 6，表明此化合物连续裂解1分子SO2及3分子六碳糖，根据正离子高能量给出的特征碎片m/z 417336 5，273220 2，255215 7，推测色谱峰5为知母色谱峰4在负离子低能量给出准分子离子峰m/z 999456 3，高能量给出m/z 837399 9，675347 9，611369 0，表明此化合物在负离子高能量下，连续裂解2分子六碳糖及1分子SO2，在正离子高能量给出m/z 433343 4，289219 9，271206 8，253198 9的特征峰，根据文献比对[14]，推测其为知母皂苷N亚硫酸酯。由于色谱峰3的相对分子质量及裂解碎片与峰4一致，推测其为知母皂苷N亚硫酸酯的异构体。峰12在负离子低能量给出m/z 821399 2的准分子离子峰，利用软件判断其分子式为C39H66O16S，由于负离子高能量给出m/z 659345 2，497299 5，表明此化合物含有2个六碳糖，在正离子高能量观察到m/z 417336 9，289215 3，271205 9，253197 3的特征碎片，推测色谱峰12为anemarrhenasaponin Ⅰ亚硫酸酯。

通过以上方法，利用这些差异性成分的精确相对分子质量、保留时间及碎片离子与对照品及相关文献比对[14]，进行结构鉴定，鉴定结果见表1，其可能的结构见图6。

33硫磺熏蒸对知母中化学成分的影响通过硫熏知母及非硫熏知母差异性成分对比分析结果可知，知母经硫熏后，新芒果苷减少，芒果苷含量增加，可能是由于硫磺在空气中燃烧，与氧及水结合生成亚硫酸，亚硫酸与氧苷类成分发生水解反应引起的含量变化[15]。对于皂苷类成分，经硫磺熏蒸后，呋甾类成分主要呈减少趋势，而螺甾类成分有一定增加。

实验室利用相同方法，硫磺熏蒸知母皂苷BⅡ及知母皂苷AⅢ的对照品发现，知母皂苷BⅡ经硫熏后含量降低，且生成了相应的亚硫酸酯衍生物，这与文献报道的结果相似[15]，可能的化学反应见图7，而知母皂苷AⅢ则无明显改变。由此推测，知母中新生成的含硫衍生物可能是硫磺燃烧生成的亚硫酸与呋甾糖苷类成分中的C22位活泼醇羟基发生酯化反应，生成相应的亚硫酸酯。

34硫磺熏蒸知母化学标志物的确定采用所建立的UPLCQTOFMSE方法快速分析非硫磺熏蒸知母及硫磺熏蒸知母，样品BPI 色谱图见图4。可发现硫磺熏蒸知母药材的化学轮廓明显不同于非硫磺熏蒸知母药材，其中色谱峰5只在硫磺熏蒸知母样品中检测到，表明硫磺熏蒸可以导致知母中的化学成分发生转化，产生了新的成分，从而改变药材的化学轮廓。通过比较发现8批硫磺熏蒸知母药材均产生一致的硫熏特征色谱峰，由于图3C中，色谱峰1显示较高的质谱响应值，且知母皂苷BⅡ为知母中的化学标志物，故将峰5（知母皂苷BⅡ亚硫酸酯，m/z 983）作为硫磺熏蒸知母的化学标志物。

4讨论

硫磺熏蒸由于其成本低、操作方便且对药材具有储藏防虫、防霉及漂白功效，仍被应用于中药材的初加工[17]。然而，硫磺熏蒸可导致部分药材或其提取物中原有活性发生变化[1819]，更会改变药效甚至产生安全隐患[7，2021]。尽管国家相关部门已颁布相关法规通过检测二氧化硫残留量来筛查硫磺熏蒸中药材，然而，由于二氧化硫易挥发，在药材加工、炮制或贮藏过程中二氧化硫残留量会随时间的增长而降低。因此，建立快速和高选择性的硫磺熏蒸中药材的筛查方法显得尤为迫切。

本研究首次利用UPLCQTOFMSE分析知母饮片硫磺熏蒸前后化学成分的差异，鉴定了16个差异性成分，并首次确定了硫熏后知母中新生成的甾体皂苷类成分的亚硫酸酯化衍生物，与文献报道中芍药苷类成分及藁本内酯类成分经硫熏后产生相应的亚硫酸酯类似[19，22]，补充了硫磺熏蒸对甾体皂苷类成分影响的研究。文献报道，人参经硫熏后人参皂苷不仅转化为亚硫酸酯，更有部分转化为人参皂苷硫酸酯[23]，然而在研究中并未发现硫酸酯化现象。硫磺熏蒸不仅带来含硫衍生物的生成，同时伴随着原有成分含量的改变，这些变化是否与化合物类型及具体结构有关仍值得进一步深入研究。endprint

本实验利用UPLCQTOFMSE建立了一种快速筛查硫磺熏蒸知母的方法，通过检测硫磺熏蒸后的化学标志物——知母皂苷BII亚硫酸酯（m/z 983），以判断知母是否经过硫磺熏蒸。与2015年版《中国药典》中二氧化硫残留检测方法相比，该方法更加便捷准确，可作为知母质量控制的有效辅助手段。

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[責任编辑孔晶晶]endprint