不同部位和不同产地加工方法的知母质量评价研究

赵小勤，黄晓婧，罗 霄，高 鹏，许 莉

不同部位和不同产地加工方法的知母质量评价研究

赵小勤，黄晓婧，罗 霄，高 鹏，许 莉*

成都市药品检验研究院 国家药监局中药材质量监测评价重点实验室，四川 成都 610045

采用UPLC-QQQ-MS/MS法同时测定不同部位和不同产地加工方法知母中9个成分的含量，并比较其差异。采用Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），流动相为0.01%甲酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱，体积流量0.4 mL/min，进样量2 μL，柱温30 ℃；质谱采用电喷雾离子源、负离子模式（ESI−），多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）。知母中新芒果苷、芒果苷、异芒果苷、知母皂苷AII、知母皂苷AIII、知母皂苷BII、知母皂苷BIII、知母皂苷E1、知母皂苷I 9个成分在各自范围内呈良好的线性关系，加样回收率97.23%～100.76%。知母的5个不同部位中知母须根中芒果苷、异芒果苷的含量最高；知母肉中知母皂苷E1、知母皂苷BII、知母皂苷I含量最高；知母头与知母片、知母肉成分差异较小。比较知母的不同产地加工方法，趁鲜切片新芒果苷和知母皂苷BII的含量较高，润切片芒果苷和知母皂苷AIII的含量较高。知母须根具有一定的开发利用价值，知母肉具有其存在的合理性；知母产地加工，可不切去知母头，以减少工序，提高知母根茎的综合利用率；趁鲜切片可加速干燥，降低饮片霉变风险。

知母；UPLC-QQQ-MS/MS；新芒果苷；芒果苷；异芒果苷；知母皂苷AII；知母皂苷AIII；知母皂苷BII；知母皂苷BIII；知母皂苷E1；知母皂苷I

知母为百合科植物知母Bge.的干燥根茎[1]，入药始载于《神农本草经》[2]。知母苦寒质润、滋清兼备，为重要的传统大宗药用品种之一，古代经典名方桂枝芍药知母汤、玉女煎、升陷汤、达原饮、二冬汤等均含知母[3]。

目前药典收载的知母产地加工方法为：采挖新鲜知母的根茎，除去须根及泥沙，晒干，习称“毛知母”；或除去外皮，晒干，习称“知母肉”[4]；“毛知母”或“知母肉”药材经中药材饮片公司收购再润切炮制成饮片（以下简称“润切片”），但因栽培知母根茎较肥大且富含黏液质，完全晒干需数月，此间知母内部极易腐败变质，严重影响其安全性和有效性。经产地调研发现[5]，随着产地加工机械化水平的不断提高，近年来在栽培知母主产地安徽亳州十九里镇和河北安国兴起趁鲜切片的加工方法，该方法可实现知母的快速干燥，有效避免内部质量变坏。但趁鲜切片和传统润切片相比，其内部有效成分有何变化，目前尚未见报道。栽培知母须根较为发达，其须根量是根茎采收量的30%左右[6]，在产地加工时作为非药用部位常被弃之不用，造成了大量的资源浪费和环境污染；经实地调研，在知母趁鲜切片时，药农常把知母根茎顶部较嫩部位（以下简称“知母头”）也切去不用；在加工知母肉的时候，外皮作为非药用部位被除去不用。但笔者在产地调研中发现，栽培知母主产区不少药农将这些非药用部位收集起来售卖给收购商，其流向和用途未知。这些知母的非药用部位与药用部位有效成分有何差异？有无药用价值？是否可以作为资源开发利用？是值得思考的问题。现代研究认为，知母中最主要的生物活性物质群为甾体皂苷和双苯吡酮类成分[9-11]，其具有抗炎[12-15]、抗血小板聚集[16-18]、降血糖[19-20]、调血脂[21-22]、改善老年痴呆症患者的学习和记忆能力[23-25]等药理活性。本实验基于UPLC-QQQ-MS-MS法，同时测定知母不同部位和不同产地加工方法的甾体皂苷类（知母皂苷AII、知母皂苷AIII、知母皂苷BII、知母皂苷BIII、知母皂苷E1、知母皂苷I）和双苯吡酮类（新芒果苷、芒果苷、异芒果苷）9个成分的含量，并结合多元变量统计分析软件对结果进行分析，探寻知母不同部位和不同产地加工方法的物质成分差异，以期为合理加工和综合利用知母资源提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器

1290型超高效液相色谱仪、6470三重四级杆质谱仪、MassHunter工作站（Agilent公司，美国）；可变速高速旋转粉碎机（FRITSCH公司，德国）；BAO-80A精密鼓风干燥箱（施都凯仪器设备上海有限公司），ME240E电子天平（Mettler Toldeo公司，瑞士）；XPE26电子天平（Mettler Toldeo公司，瑞士）；SK250H超声仪（上海科导超声仪器有限公司）；Milli-Q Advantage A10 型超纯水仪（Millipore公司，美国）。

1.2 材料

对照品芒果苷（批号111607-201503，质量分数98.4%）、知母皂苷BII（批号111839-201505，质量分数94.4%）对照品购自中国食品药品检定研究院；新芒果苷（批号16042232，质量分数99.73%）、异芒果苷（批号MUST16100905，质量分数99.81%）、知母皂苷AII（批号MUST16112415，质量分数99.59%）、知母皂苷AIII（批号MUST16020108，质量分数98.78%）、知母皂苷BIII（批号MUST17022210，质量分数96.93%）、知母皂苷E1（批号MUST17031401，质量分数99.15%）、知母皂苷I（批号MUST16112412，质量分数99.43%）对照品均购自成都曼斯特生物科技有限公司。

乙腈为色谱纯，德国Merck公司；甲酸为质谱级，美国Fisher公司；水为实验室自制超纯水。知母药材样品均为实地采集，经成都市食品药品检验研究院罗霄副主任中药师鉴定为百合科知母Bge.的根及根茎，样品信息见表1、2。

表1 5批不同部位的知母样品

表2 7批不同产地加工方法的知母样品

2 方法与结果

2.1 样品的处理

2.1.1 不同部位知母样品处理 分别取表1中同一株知母，剪下须根（知母须，部位1），将剩余部位随机分为3份；第1份切取根茎顶部3 cm，切片（知母头，部位2）；第2份整体切片（知母片，部位3）；第3份刮取知母皮（知母皮，部位4），将去皮的知母根茎切片（知母肉，部位5）。所有样品60 ℃烘干（水分含量低于11%），打粉，过三号筛，备用。

2.1.2 不同产地加工方法知母样品处理 取表2中每批知母，随机分为2份，一份趁鲜切片，60 ℃烘干（以下简称“鲜切片”）；一份自然晒干（毛知母），取一半毛知母洒水喷淋软化润切为知母片（毛知母润切片，以下简称“润切片”），60 ℃烘干。所有样品，打粉，过三号筛，备用。

2.2 色谱和质谱条件[26]

2.2.1 色谱条件 色谱柱为Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱温30 ℃；流动相为0.01%甲酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱程序：0～3 min，93% A；3～7.5 min，93%～87% A；7.5～8 min，87%～78% A；8～11 min，78%～65% A；11～12.5 min，65%～55% A；12.5～18 min，55%～20% A；18～20 min，20%～5% A；体积流量0.4 mL/min；进样量为2 μL。

2.2.2 质谱条件 质谱采用电喷雾离子源（ESI）；负离子模式；多反应监测（MRM）；干燥气温度：350 ℃；干燥气体积流量：8 L/min；雾化器压力：25 psi（1 psi＝6.895 kPa）；离子源喷雾电压：3 000 V；EMV：750。各成分质谱参数见表3。混合对照品溶液、供试品溶液的总离子流图见图1。

2.3 对照品储备液的制备

精密称取新芒果苷、芒果苷、异芒果苷、知母皂苷AII、知母皂苷AIII、知母皂苷BII、知母皂苷BIII、知母皂苷E1、知母皂苷I对照品适量，分别加50%甲醇配制成2.054、1.568、1.591、1.528、1.931、3.247、1.534、3.157、3.874 mg/mL的对照品储备液，在4 ℃下避光保存。

表3 9种成分的质谱参数

*为定量碎片离子

*quantitative fragment ion

1-新芒果苷 2-芒果苷 3-异芒果苷 4-知母皂苷E1 5-知母皂苷BII 6-知母皂苷BIII 7-知母皂苷I 8-知母皂苷AII 9-知母皂苷AIII

2.4 供试品溶液的制备

取本品粉末约0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇溶液50 mL，称定质量，超声处理40 min，放冷，再称定质量，用50%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液0.1 mL置50 mL量瓶中，加50%甲醇至刻度，摇匀，即得。

2.5 线性关系、最低检出限（LOD）和最低定量限（LOQ）

分别精密吸取新芒果苷、芒果苷、异芒果苷、知母皂苷AII、知母皂苷AIII、知母皂苷BII、知母皂苷BIII、知母皂苷E1、知母皂苷I对照品储备液适量，置同一量瓶中，加50%甲醇逐级稀释成系列对照品溶液，精密吸取2 μL，按“2.2”项色谱和质谱条件进行测定。以对照品质量浓度为横坐标（），相应峰面积为纵坐标（）作线性回归，绘制标准曲线。逐步稀释对照品溶液，以信噪比（/）3为LOD，/10为LOQ，结果见表4。

表4 9种成分线性回归方程、相关系数、线性范围、LOD和LOQ

2.6 精密度试验

取同一对照品溶液连续进样6次，记录峰面积。新芒果苷、芒果苷、异芒果苷、知母皂苷AII、知母皂苷AIII、知母皂苷BII、知母皂苷BIII、知母皂苷E1、知母皂苷I峰面积的RSD分别为0.68%、0.98%、1.21%、1.25%、0.45%、0.96%、1.51%、2.19%、1.83%，表明仪器精密度良好。

2.7 重复性试验

取同一样品（BW3，知母片）6份，按“2.4”项下方法平行制备供试品溶液，进样。测得新芒果苷、芒果苷、异芒果苷、知母皂苷AII、知母皂苷AIII、知母皂苷BII、知母皂苷BIII、知母皂苷E1、知母皂苷I的质量分数平均值分别为37.97、8.47、1.43、0.31、1.65、62.35、2.83、2.85、3.41mg/g，RSD值分别为0.65%、0.78%、1.23%、1.37%、1.05%、0.84%、1.24%、0.95%、0.67%，表明方法重复性良好。

2.8 稳定性试验

取同一供试品溶液，分别于0、4、8、16、24 h，按“2.2”项色谱和质谱条件进行分析，测得新芒果苷、芒果苷、异芒果苷、知母皂苷AII、知母皂苷AIII、知母皂苷BII、知母皂苷BIII、知母皂苷E1、知母皂苷I的峰面积，RSD值分别为0.25%、0.38%、1.25%、0.87%、1.32%、0.58%、1.01%、1.35%、1.24%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.9 加样回收率试验

精密称取已测定9种成分含量的同一知母样品9份，每份取约0.1 g。取新芒果苷、芒果苷、异芒果苷、知母皂苷AII、知母皂苷AIII、知母皂苷BII、知母皂苷BIII、知母皂苷E1、知母皂苷I对照品适量配制成适当质量浓度的对照品溶液，以样品中各成分量的50%、100%、150%加入样品粉末中，平行制备3份，按照“2.4”项下方法制备供试品溶液，进样分析。结果新芒果苷、芒果苷、异芒果苷、知母皂苷AII、知母皂苷AIII、知母皂苷BII、知母皂苷BIII、知母皂苷E1、知母皂苷I的平均回收率分别为99.87%、98.15%、97.23%、98.65%、100.76%、99.24%、98.43%、98.37%、97.53%，RSD值分别为1.67%、1.78%、2.33%、1.49%、1.85%、1.75%、2.14%、2.61%、2.57%。

2.10 样品测定

分别精密称取各批次知母样品粉末，每批约0.2 g，依照“2.4”项所述方法制备供试品溶液，每批平行制定3份，精密吸取供试品溶液2 μL，按“2.2”项测定条件进行分析，以标准曲线法分别计算各样品中新芒果苷、芒果苷、异芒果苷、知母皂苷AII、知母皂苷AIII、知母皂苷BII、知母皂苷BIII、知母皂苷E1、知母皂苷I的含量，结果见表5、6。

表5 5批不同部位知母的样品含量测定结果(n＝3)

表6 7批不同产地加工方法的样品含量测定结果(n＝3)

2.11 样品测定结果统计分析

本研究以知母中9个化学成分的含量为变量，采用多元变量统计分析软件SIMCA 14.1对2.9项下结果采用正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）建立分析模型（图2、3）。从图2可看出，不同部位知母样品知母头、知母肉、知母片聚为一类，知母须和知母皮各聚为一类，表明知母须与知母皮较接近，而与其他部位差异较大。为进一步显示知母不同部位样品中化学成分的含量特征，绘制了不同部位9种化学成分的平均含量雷达图，见图4。由于各成分含量存在一定差异，将各成分含量乘以相应系数进行修正，具体系数：新芒果苷为3、芒果苷为8、异芒果苷为30、知母皂苷E1为20、知母皂苷BII为1、知母皂苷BIII为40、知母皂苷I为15、知母皂苷AII为265、知母皂苷AIII为20。

图2 不同部位OPLS-DA得分散点图

图3 不同产地加工方法OPLS-DA得分散点

由图4可见，知母须中新芒果苷、知母皂苷AIII、知母皂苷E1、知母皂苷BIII、知母皂苷BII、知母皂苷I 6个成分含量在5个部位中最低，其中3批未检出具有重要药理活性的主要化学成分知母皂苷BII；但其芒果苷、异芒果苷含量在5个部位中最高。知母皮中新芒果苷、知母皂苷AIII、知母皂苷E1、知母皂苷BII、知母皂苷I的含量在5个部位中仅比知母须高，比知母头、知母肉、知母片都低。而去皮去须的知母肉中知母皂苷E1、知母皂苷BII、知母皂苷I含量在5个部位中最高。由图3可见，不同产地加工方法的知母样品鲜切片聚为一类，毛知母和润切片聚为一类。为进一步显示知母不同产地加工样品中化学成分的含量特征，绘制了不同产地加工方法知母样品中9种化学成分的平均含量雷达图，见图5。由于各成分含量存在一定差异，将各成分含量乘以相应系数进行修正，具体系数：新芒果苷为8，芒果苷为4，异芒果苷为20，知母皂苷E1为25，知母皂苷BII为1，知母皂苷BIII为12，知母皂苷I为10，知母皂苷AII为65，知母皂苷AIII为4。由图5可知，鲜切片中新芒果苷、知母皂苷BII、知母皂苷E1三者含量较毛知母、润切片高，而其余成分均较毛知母、润切片中低。

图4 不同部位各成分平均含量雷达图

3 讨论

知母须中新芒果苷、知母皂苷AIII、知母皂苷E1、知母皂苷BIII、知母皂苷BII、知母皂苷I等6个成分含量在5个部位中最低，其中3批未检出具有抗氧化[28-29]、抗血栓[16]、抗抑郁[30]、抗炎[31-32]等重要药理活性的主要化学成分知母皂苷BII，可见知母须在产地加工中作为非药用部位弃去具有一定的合理性；但其芒果苷、异芒果苷含量在5个部位中最高，芒果苷也为知母具有抗炎[31]、降血糖[33]重要药理活性的主要化学成分。文献报道，李丽丽等[7]认为知母须根对糖氧剥夺损伤的PC12细胞具有保护作用，廖振东等[8]从知母须根中发现一个新的二苯甲酮类化合物并认为该化合物具有对H2O2诱导的SH-SY5Y细胞损伤的神经保护活性。因此，知母须具有一定的开发利用价值，可考虑用于芒果苷提取、开发成方制剂以及保健品等。知母皮化学成分含量与知母须较接近，而与知母头、知母肉、知母片差异较大；其所含新芒果苷、知母皂苷BII等多个成分含量在5个部位中仅比知母须高，比知母头、知母肉、知母片都低。而去皮去须的知母肉中知母皂苷E1、知母皂苷BII、知母皂苷I含量在五个部位中最高，其中知母皂苷BII在9个成分中含量最高且具有重要的药理活性成分，因此，知母肉的加工方法具有其存在的合理性。知母皮为加工知母肉的废弃物，因加工知母肉需耗费大量人力，产生的知母皮数量极少，不具备开发利用的规模。因知母头与知母片差异较小，笔者认为在加工过程可不必切去知母头，以减少工序，提高知母根茎的综合利用率。

图5 不同产地加工方式各成分平均含量雷达图

对不同产地加工方法的知母样品进行分析发现，新芒果苷的含量：鲜切片＞毛知母＞润切片；芒果苷的含量：润切片＞毛知母＞鲜切片。笔者前期对188批知母样品中新芒果苷、芒果苷含量与水分进行相关性分析，结果表明高含水率的情况下，新芒果苷容易转化为芒果苷[27]。笔者认为，鲜切片因迅速脱水干燥，新芒果苷含量高，芒果苷含量低；新鲜知母晒干变为毛知母过程脱水缓慢，故部分新芒果苷转化为芒果苷；毛知母洒水喷淋软化润切为饮片过程中含水率提高，部分新芒果苷转化为芒果苷。经笔者前期文献调研，芒果苷、知母皂苷BII、知母皂苷AIII为知母中重要的药理活性成分[26]，这三者也是知母中含量较高的化学成分。知母皂苷BII的含量：鲜切片＞毛知母≈润切片，知母皂苷AIII的含量：润切片＞毛知母＞鲜切片。鲜切片新芒果苷和知母皂苷BII的含量高，润切片芒果苷和知母皂苷AIII的含量高，其他5个成分变化无规律，因此，仅从9种化学成分的含量多少的角度无法评价2种产地加工方法的优劣。但鲜切片干燥迅速，不容易发霉变质，饮片质量和安全性更有保障，笔者建议采用趁鲜切片的产地加工方法，如用于治疗糖尿病等需芒果苷含量较高的饮片，可通过改变生产工艺如增加知母饮片的浸泡时间等尝试实现，如何优化知母产地加工方法和提取工艺，有待进一步研究。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

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Quality evaluation offor different parts and different processing methods

ZHAO Xiao-qin, HUANG Xiao-jing, LUO Xiao, GAO Peng, XU Li

Chengdu Institute for Drug Control, NMPA Key Laboratory for Quality Monitoring and Evaluation of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 610045, China

To determine the contents of 9 components infor different parts and different processing methods by UPLC-QQQ-MS/MS method,and compared the differences.The sample were separated on an Waters ACQUITY UPLC BEH C18column(100 mm × 2.1mm,1.7 μm), the mobile phase composed of 0.01% formic acid solution (A) - acetonitrile (B) with gradient elution.the flow rate was 0.4 mL/min and the injection volume was 2 μL.The column temperature was 30 ℃.Multiple-reaction monitoring（MRM）scanning was employed for quantification in negative ion mode under electrospray ion.The nine components (neomangiferin, mangiferin, isomangiferin, timosaponin E1,timosaponin BII,timosaponin BIII,anemarrhenasaponin I,timosaponin AII and timosaponin AIII) all showed good linear relationship in their respective ranges,the average recoveries of 9 components were 97.23%—100.76%.Among the five different parts of,the contents of mangiferin and isomangiferin were the highest in the fibrous root of, the contents of timosaponin E1, timosaponin BII and anemarrhenasaponin I inwith outer cork removed (called zhimurou) were the highest,there was little difference in the components among the apex in rhizome of(called zhimutou), Anemarrhenae Rhizoma pieces and zhimurou.Compared the different habitat processing methods of, the content of neomangiferin and imosaponin BII were higher in fresh-cut slices, while the content of mangiferin and timosaponin AIII were higher in traditional-cut slices.The fibrous root ofis valuable in development and utilization, and the existence of zhimurou is rational.Zhimutou can be reserved in the habitat processing ofin order to reduce the working procedure and improve the comprehensive utilization rate of the rhizome of.Fresh-cut slices can accelerate drying and reduce the risk of mildew.

; UPLC-QQQ-MS/MS; neomangiferin; mangiferin; isomangiferin; timosaponin E1; timosaponin BII; timosaponin BIII; anemarrhenasaponin I; timosaponin AII; timosaponin AIII

R286.2

A

0253 - 2670(2021)22 - 6990 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.22.026

2021-05-06

2017年国家药品计划抽验项目（中检监督函<2017>61号，中央补助地方经费项目）

赵小勤（1987—），女，主管中药师，硕士，从事中药材鉴定、中药质量分析。Tel: (028)85362592 E-mail: 358235392@qq.com

通信作者：许 莉（1987—），女，副主任中药师，博士，从事中药品质评价研究。Tel: (028)85362592 E-mail: xulicd1987@sina.com

[责任编辑 时圣明]