设计空间法研究龙血竭酚类提取物的精制工艺

张建 张欣 毕宇安 徐桂红 黄文哲 王振中 萧伟

[摘要]运用质量源于设计（QbD）理念，采用“设计空间”方法优化龙血竭酚类提取物的精制工艺。首先将龙血素B、7，4′二羟基黄酮含量及其转移率、总干膏收率等5个指标做为关键质量属性（CQA），采用PlackettBurman设计实驗，发现关键工艺参数（CPP）为碱浓度、碱倍量和碱溶温度。再采用BoxBehnken设计建立CQA和CPP间的数学模型，方差分析显示模型P均小于005，失拟值均大于005，可以较好的描述CQA和CPP之间的关系。设定龙血素B、7，4′二羟基黄酮含量及其转移率、总干膏收率5个指标的控制限度，通过Monte Carlo仿真法计算获得基于概率的设计空间并验证。结果表明，优化后的纯化方法能够保证龙血竭酚类提取物精制工艺稳定，有助于提高酚类提取物批次间质量均一性，为生产自动化控制提供数据支撑。

[关键词]龙血竭酚类提取物； 精制工艺； 关键工艺参数； 关键质量属性； 设计空间

Studying on purification technology of Resina Draconis phenol

extracts based on design space method

ZHANG Jian1，3， ZHANG Xin2，3， BI Yuan2，3， XU Guihong2，3， HUANG Wenzhe2，3， WANG Zhenzhong2，3， XIAO Wei1，2，3*

（1. College of Pharmacy， Nanjing University of Chinese Medicine， Nanjing 210023， China；

2. Jiangsu Kanion Parmaceutical Co.， Ltd.， Lianyungang 222001， China；

3. State Key Laboratory of Pharmaceutical Process Newtech for Chinese Medicine， Lianyungang 222001， China）

[Abstract]The "design space" method was used to optimize the purification process of Resina Draconis phenol extracts by using the concept of "quality derived from design" （QbD） The content and transfer rate of laurin B and 7，4'dihydroxyflavone and yield of extract were selected as the critical quality attributes （CQA） PlackettBurman design showed that the critical process parameters （CPP） were concentration of alkali， the amount of alkali and the temperature of alkali dissolution Then the BoxBehnken design was used to establish the mathematical model between CQA and CPP The variance analysis results showed that the P values of the five models were less than 005 and the mismatch values were all greater than 005， indicating that the model could well describe the relationship between CQA and CPP Finally， the control limits of the above 5 indicators （content and transfer rate of laurine B and 7，4'dihydroxyflavone， as well as the extract yield） were set， and then the probabilitybased design space was calculated by Monte Carlo simulation and verified The results of the design space validation showed that the optimized purification method can ensure the stability of the Resina Draconis phenol extracts refining process， which would help to improve the quality uniformity between batches of phenol extracts and provide data support for production automation control

[Key words]Resina Draconis phenol extracts； refining process； critical process parameters； critical quality attributes； design space

龙血竭酚类提取物为中药5类新药龙血通络胶囊的原料药，具有活血化瘀通络之功效，可用于中风病经络（轻中度脑梗死）恢复期血瘀证。其有效部位总酚主要包括查耳酮类、黄酮类、黄烷类、色原酮类、茋类及简单酚类[1]，具有抗炎、镇痛、活血、止血、抗细菌、真菌、改变血液流变学等药理作用，其中7，4′二羟基黄酮、龙血素B具有抗血栓、抗血瘀、抗凝血、镇痛多重功效[2]。endprint

由于龙血竭酚类提取物中酚类化合物与杂质间溶解度和pKa等性质接近，总酚和杂质组分复杂（已指认出18种化合物[3]），对其溶解度的影响因素多且存在交互作用，难以通过单因素等简单实验或者正交试验获得所有参数的合理范围，所以其精制工艺一直是工业生产控制的难点。

目前，质量源于设计（QbD）的理念正推动中药制剂生产模式的转变[4]，认为只有应用“正确”的过程才能生产出“优质”的产品[5]。在ICH Q8中，设计空间被定义为：可以确保产品质量的输入变量（例如原材料属性）和工艺参数之间的多维结合与相互作用。在设计空间之内的操作不称为工艺变更，设计空间之外的操作则视为工艺变更[6]。

QbD理念采用的设计空间法能够提供稳健生产的工艺参数范围，确保产品质量的一致性，目前已用于水提、醇沉、水沉和柱色谱等工艺的参数优化[711]。本文以龙血竭酚类提取物为研究对象，运用QbD理念优化龙血竭酚类提取物精制工艺，建立关键工艺参数和关键质量属性间的数学模型，通过Monte Carlo仿真法计算获得基于概率的设计空间并进行验证。

1材料

Ultimate 3000高效液相色谱仪，DAD紫外检测器（德国Thermo Fisher公司）；Mettler XP6电子分析天平（瑞士Mettler公司）；Mettler AE240电子分析天平（瑞士Mettler公司）；Sartorius BSA 224SCW型电子分析天平（德国Sartorius公司）；MilliQ Academic纯水机（美国Millipore公司）；H1659台式高速离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；K250DB型超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）。

龙血素B（批号111558201407，供含量测定用）、7，4′二羟基黄酮（批号111787201002，供含量测定用）对照品购自中国食品药品检定研究院。乙腈（色谱纯，美国天地公司）、甲酸（色谱纯，ROE Scientific公司）、氢氧化钠（南京化学试剂股份有限公司）、无水乙醇（南京化学试剂股份有限公司）、盐酸（南京化学试剂股份有限公司）、水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

龙血竭干膏由龙血竭提取、浓缩、干燥制得（江苏康缘药业股份有限公司）。

2方法

21龙血竭酚类提取物精制工艺

取龙血竭干膏20 g，加入一定浓度氢氧化钠溶液中搅拌溶解，滤液用稀盐酸调pH，沉淀干燥，粉碎，即得。

22分析方法及方法學验证

221混合对照品溶液的制备取7，4′二羟基黄酮、龙血素B对照品适量，精密称定，加80%乙醇配制成质量浓度分别为3884，5088 mg·L-1的混合对照品溶液，即得。

222供试品溶液的制备取龙血竭酚类提取物，混匀，研细，取约05 g，精密称定，置50 mL量瓶中，加入80%乙醇适量，超声（250 W，40 kHz）提取30 min，放冷，定容至刻度，摇匀，即得。

223色谱条件Kromasil 1005 C18色谱柱（46 mm×250 mm， 5 μm），流动相乙腈（B）01%甲酸水（C）溶液，梯度洗脱（0～30 min，22%～40% B；30～60 min，40%～48% B），体积流量10 mL·min-1，检测波长280 nm（龙血素B定量测定）和325 nm（7，4′二羟基黄酮定量测定），柱温35 ℃，进样量10 μL[1213]。混合对照品和供试品的HPLC图见图1。

224标准曲线和线性范围考察精密称取龙血素B 302 mg，7，4′二羟基黄酮297 mg，以80%乙醇溶解并定容至5 mL量瓶，作为标准曲线的最高浓度，逐倍稀释至标准曲线各浓度溶液。以进样质量浓度为横坐标（X），峰面积积分值为纵坐标（Y），绘制回归曲线，计算回归方程、相关系数和线性范围。

225加样回收率样品制备方法取同一供试品，研细，取约025 g，精密称定，共称取6份，置50 mL量瓶中，分别精密加入混合对照品溶液（各指标成分质量浓度分别为7，4′二羟基黄酮405 mg·L-1、龙血素B 496 mg·L-1）5 mL，加入80%乙醇适量，

232回归模型的建立根据PlackettBurman实验筛选出的关键工艺参数，采用BoxBehnken设计研究建立龙血竭酚类提取物精制过程的关键工艺参数和关键质量属性之间的数学模型。各因素和相应水平见表3，具体条件见表4，试验设计由DesignExpert 80（美国StatEase公司）完成。

3结果与讨论

31酚类提取物含量测定分析方法学验证

根据本研究样品的实际含量，对文献[13]方法进行方法学验证，标准曲线结果分别为龙血素B：Y=9559X-5048，r=0999 9，线性范围1890～6047 mg·L-1；7，4′二羟基黄酮：Y=18679X+4873，r=0999 7，线性范围1859～5948 mg·L-1。加样回收率结果为龙血素B、7，4′二羟基黄酮平均回收率分别为9967%，1009%，RSD均小于26%，证明该分析方法准确、可靠，可用于本研究中酚类化合物含量测定。

32关键工艺参数的筛选

关键工艺参数筛选见表2。首先对关键质量属性（Y1～Y5）进行标准化处理[1416]，然后通过多元线性回归建立工艺参数和指标之间的定量模型，见公式（1）。

Y=a0+∑5i=1axiXi（1）

其中a0为常数项，Xi为工艺参数，ai为参数Xi对指标Y的偏回归系数。然后将各偏回归系数的绝对值加权求和。多元线性回归计算由DesignExpert 80（美国StatEase公司）完成。各指标相应的偏回归系数及决定系数见表5。结果显示5个模型的R2在0864～0956，表明各个模型均能较好的描述工艺参数对指标成分的影响。endprint

为了简化计算，假设所有指标成分的重要性相同，在计算各工艺参数偏回归系数的绝对值之和时，将所有指标模型中的偏回归系数权重均设为1，即表5中偏回归系数绝对值大小表征各个工艺参数对每个指标成分的影响。其中偏回归系数绝对值之和排列顺序为：碱溶温度>碱倍量>碱浓度>pH>酸沉温度，由此可知碱溶温度、碱倍量和碱浓度是龙血竭酚类提取物精制过程的关键工艺参数。

33回归模型的分析

331模型的建立及分析關键工艺参数与关键质量属性之间的数学模型采用下式计算，见公式（2）。

y=b0+∑3i=1biXi+∑3i=1bjX2j+∑2i=1∑3j=i+1bijXiXj（2）

其中，b0为常数项，bi，bj，bij为偏回归系数。采用逐步回归法简化方程，模型移入或移除特定项的P设定为010。逐步回归采用DesignExpert 80（美国StatEase公司）计算。BoxBehnken结果见表4，采用二次多项式模型对CQA（Y1， Y2， Y3， Y4， Y5）及相应的CPP（A， B， C）分别进行拟合，模型的偏回归系数、R2和P结果见表6。

5个模型的拟合决定系数R2均大于093，说明模型能解释大部分变异，响应值的实际值与预测值之间具有较好的拟合度，具有很好的预测能力。方差分析结果显示P均小于005，模型具有显著性；失拟值均大于005，实验误差不显著，说明模型对实验拟合的情况较好，各因素与响应值之间的关系可以用此模型函数化。

方差结果分析以Y2（7，4′二羟基黄酮含量）、Y5（干膏收率）为例，见表7，8。A， B和C对Y2和Y5有显著影响，其中Y2在回归分析时AB， AC， BC的P均小于005，说明A， B， C之间存在交互作用。

332响应面分析以Y2（7，4′二羟基黄酮含量）、Y5（干膏收率）为例来说明指标成分的含量、干膏收率随碱浓度、碱倍量、碱溶温度变化而呈现的规律。

7，4′二羟基黄酮含量等高线图见图2，结果表明碱浓度越低，碱倍量越低，碱溶温度越低，7，4′二羟基黄酮含量就越高。

干膏收率的等高线图见图3，结果表明碱浓度越高，碱倍量越高，碱溶温度越低碱溶酸沉后干膏收率就越高。

34设计空间的确立及验证

采用模拟重复试验结果的 Monte Carlo法计算设计空间，由MODDE软件（Umetrics公司）自编程序进行计算。根据产品质量要求设定5个指标下限值，计算出设计空间。关键质量属性可接受范围及达标概率，见表9，运用Monte Carlo法计算获得基于概率的设计空间，见图4。

碱溶温度在55～60 ℃下设计空间形状大致相同，所以只展示55 ℃的设计空间；图4中颜色由绿至红的渐变表示响应值失败概率由05%逐渐增大。为了验证设计空间的准确性，在设计空间内外各选3个点进行验证，6个点分别表示为V1，V2，V3，V4，V5，V6，结果见表10。从验证结果可知，预测值和实际值接近，模型预测性好，因此在设计空间内操作可以保证工艺的稳健性。

4结论

本文为解决龙血竭酚类提取物中酚类成分的纯化工艺问题，运用质量源于设计（QbD）理念，采用“设计空间”方法优化龙血竭酚类提取物精制工艺。利用PlackettBurman设计和偏回归系数法，研究发现碱浓度、碱倍量、碱溶温度为关键工艺参数；再采用BoxBehnken设计和逐步回归法，建立了CQA和CPP的数学模型；最后运用Monte Carlo法计算出龙血竭酚类提取物精制工艺的设计空间，并通过了实验验证。

酚类化合物由于结构差异，拥有不同的pKa，因此在不同pH溶液中，具有不同的溶解度。龙血竭酚类提取物精制即是通过有效成分与杂质溶解度的差异实现对龙血竭总酚的纯化。本文通过寻找关键工艺参数、建立CQA和CPP间关系的数学模型、建立设计空间的方法有效地解决了这个问题，找到合适的设计空间，提高了工艺过程的稳健性和灵活性，为探索酚类化合物的纯化工艺提供了有益的参考。优化后的纯化方法能够保证龙血竭酚类提取物精制工艺稳定，有助于提高批次间质量均一性，为生产自动化控制提供数据支撑。

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[责任编辑孔晶晶]endprint