15种重楼属植物中8种甾体皂苷的含量测定

黄圆圆 刘大会 彭华胜 郝庆秀 陈美兰 张啊中 陈敏 康利平 黄璐琦

[摘要]建立了同時测定重楼中 8种重楼皂苷（重楼皂苷Ⅶ、H、Ⅵ、Ⅱ、Ⅰ、Ⅴ， 薯蓣皂苷和纤细薯蓣皂苷）的分析方法，并对15种重楼属植物根茎中重楼皂苷的含量进行了评价。本研究采用Waters Acquity HClass TM液相色谱系统，PDA检测器，色谱柱为资生堂CAPCELL PAK ADME 色谱柱（46 mm×250 mm， 5 μm），乙腈水为流动相（08 mL·min-1）梯度洗脱，柱温21 ℃；检测波长为203 nm。可知①8种重楼皂苷得到良好分离，稳定性和重复性好，且线性良好（R2>0999 9），线性范围较宽（0041 70～3812 00 μg），平均回收率在9591%～1038%。②不同种重楼中重楼皂苷的含量差异显著，毛重楼、狭叶重楼和金线重楼中含量较低或基本不含重楼皂苷，不适合作为重楼药用；不同产地的七叶一枝花含量差异显著；滇重楼、长柱重楼、大理重楼和五指莲中重楼皂苷含量较高，最高达50%，长柱重楼、大理重楼和五指莲可作为潜在的重楼药用资源。

[关键词]重楼属； 甾体皂苷； 含量测定； 高效液相色谱法

Determination of eight steroidal saponins in 15 kinds of genus Paris

HUANG Yuanyuan1，2， LIU Dahui3， PENG Huasheng1， HAO Qingxiu2， CHEN Meilan2，

ZHANG Azhong4， CHEN Min2， KANG Liping2*， HUANG Luqi2*

（1School of Pharmacy， Anhui University of Chinese Medicine， Hefei 230012， China；

2State Key Laboratory Breeding Base of Daodi Herbs， National Resource Center for Chinese Materia Medica， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China；

3College of Pharmacy， Hubei University of Chinese Medicine， Wuhan 430065， China；

4Lanping County in Ecological Industry Co， Ltd， Nujiang 673100， China）

[Abstract]The study was established an HPLC method for simultaneous determination of 8 steroidal saponins （polyphyllins Ⅶ， H， Ⅵ， Ⅱ， Ⅰ， and Ⅴ， dioscin， and gracillin） in Paridis Rhizoma， and made an evaluation by determining steroidal saponins in 15 kinds of genus Paris The analysis was performed on a Waters Acquity HClassTM UPLC ultrafine liquid chromatography system coupled with a PDA detector The chromatographic separation was achieved through a CAPCELL PAK ADME （46 mm× 250 mm， 5 μm） column and the optimal mobile phase consisted of acetonitrile and water The column was maintained at 21 ℃， and the flow rate was 08 mL·min-1 The UV detection wavelength was 203 nm The results showed that ① the detected components can be well separated and all with good correlation coefficients The standard calibration curves were linearly good （R2>0999 9） The linearity was obtained over 0041 703812 00 μg The average recoveries ranged from 9591% to 1038% ② there are significant differences in the content of steroidal saponins from different species The steroidal saponins are low content or almost none in P. mairei， P. polyphylla var stenophylla， and P. delavayi have low content or almost did not contain， so these species are not suitable for medicinal use The contents of steroidal saponins in P. polyphylla var chinensis are varied from different places There were high content of steroidal saponins in P. polyphylla var yunnanensis， P. forrestii， P. daliensis， and P. axialis， even up to 50%， which indicated that they had the potential pharmic value of developmentendprint

[Key words]Paris L； steroidal saponins； content determination； HPLC

重楼用药历史悠久，最早以“蚤休”之名收载于《神农本草经》，其后历代本草古籍均有记载。2015版《中国药典》收录重楼为百合科重楼属云南重楼Paris polyphylla Smith var yunnanensis （Franch） Hand-Mazz或七叶一枝花P. polyphylla Smith var chinensis（Franch） Hara的根茎。重楼性寒、味苦，具有清热解毒、消肿止痛、凉肝定惊等功效，用于咽喉肿痛、毒蛇咬伤、跌打伤痛、惊风抽搐等证[1]。现代研究表明其主要化学成分为甾体皂苷类化合物，具有止血、抗肿瘤、抗病毒、抗菌等药理活性[24]。重楼大量应用在40余种中成药中，如云南白药、宫血宁、金复康口服液、楼连胶囊和季胜德蛇药片等[5]。随着重楼需求量的不断增长及巨额利润的驱动，长期掠夺式的采挖直接导致重楼的野生资源更加稀缺。重楼繁殖率低，再生较慢，各产区药材蕴藏量普遍下降，部分品种已濒临灭绝[6]；虽然目前有人工种植，但重楼种植周期长，投资风险较高，资源匮乏已是不争事实[7]。

我国约有19种重楼属植物（不含变种）[8]，在实际使用中，除滇重楼和七叶一枝花外，其他重楼属品种在民间也常作为重楼使用。王跃虎等[9]通过整理文献，统計出18个药用种和变种。不同种重楼在化学成分上虽有其相似之处，但也存在着很大的差异[1012]，它们是否都能够作为重楼入药是个值得探讨的问题。2015年版《中国药典》仅仅是将重楼皂苷Ⅰ，Ⅱ，Ⅵ，Ⅶ的总含量作为重楼质量评价的标准，而重楼皂苷H、重楼皂苷V、薯蓣皂苷和纤细薯蓣皂苷也均为重楼中主要活性成分， 具有显著的止血和细胞毒等活性[4，9]，所以药典方法并不能全面反映重楼的质量优劣。虽然有学者对重楼中活性成分进行了定量分析[1315]，但多是针对药典收载的2个品种，目前尚未见有关重楼属多种植物皂苷成分系统的定量分析报道。为了更加全面评价重楼药材的质量，本实验建立了HPLC 同时测定8种重楼甾体皂苷含量的方法，并对收集到的15种重楼的皂苷含量进行了测定和分析。

1材料

Waters Acquity HClass UPLCTM液相色谱仪串联外接柱温箱（包括四元溶剂管理器、真空脱气机、自动进样器、PDA检测器、Empower 3工作站，美国Waters 公司），电热恒温水浴锅（天津市泰斯特仪器有限公司），METTLER TOLEDO XS105DU分析天平（梅特勒托利多国际贸易（上海）有限公司），超声波清洗器（SB800 DTD，宁波新芝生物科技股份有限公司），资生堂CAPCELL PAK ADME 色谱柱（46 mm×250 mm，5 μm）。

乙醇（分析纯，批号20160918）购自北京化工厂，甲醇（色谱纯，UN 1230）和乙腈（色谱纯，UN 1648）购自德国默克股份有限公司，超纯水自制（Thermo Barnstead GenPure UV/UF）。

对照品重楼皂苷Ⅶ（纯度925%，批号111593201303）、重楼皂苷Ⅵ（纯度951%，批号111592201203）、重楼皂苷Ⅱ（纯度934%，批号111591201103）和重楼皂苷Ⅰ（纯度936%，批号111590201604）购自于中国食品药品检定研究院，重楼皂苷H（纯度≥98%，批号H036161001）、重楼皂苷Ⅴ（纯度≥98%，批号H036150215）、薯蓣皂苷（纯度≥98%，批号S048160408）、纤细薯蓣皂苷（纯度≥98%，批号X053151111）购于北京融诚鑫德科技发展有限公司。

15种重楼实验样品主要采于云南，部分来自河南、福建和湖北，均经安徽中医药大学彭华胜教授鉴定为七叶一枝花P. polyphylla var chinensis、滇重楼P. polyphylla Smith var yunnanensis（Franch） Hand -Mazz、南重楼P. vietnamensis （Takht） H Li、长柱重楼P. forrestii （Takht） H Li、金线重楼P. delavayi Franch、长药隔重楼P. polyphylla varpseudothibetica H Li、黑籽重楼P. thibetica Franch、大理重楼P. daliensis H Li et V G Soukup、毛重楼P. mairei Lévl、五指莲P. axialis H Li、多叶重楼P. polyphylla Smith、狭叶重楼P. polyphylla var stenophylla Franch、卵叶重楼P. delavayi var petiolata（Baker ex C H Wright） H Li、球药隔重楼P. fargesii Franch、短瓣球药隔重楼P. fargesii var brevipetalata （Huang et Yang） H Li 共计15种，样品详细信息见表1。所有植物标本存于安徽中医药大学药学院。

2方法和结果

21色谱条件

色谱柱CAPCELL PAK ADME 色谱柱（46 mm×250 mm，5 μm）；流动相乙腈（A）水（B）； 梯度洗脱0～9 min，35%～44% A， 9～22 min，44% A，22～38 min，44%～47% A， 38～39 min，47%～98% A；流速08 mL·min-1；检测波长203 nm；柱温21 ℃；进样量10 μL。重楼皂苷对照品和重楼样品的色谱图，见图1。

22供试品溶液的制备

取重楼药材粉末约05 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇25 mL，称重，加热回流30 min，放冷，再称重，用70%乙醇补足失重，摇匀，高速离心15 min，取上清液过022 μm微孔滤膜，取续滤液，即得。endprint

23对照品溶液的制备

分别精密称取适量重楼皂苷Ⅶ、重楼皂苷H、重楼皂苷Ⅵ、重楼皂苷Ⅱ、薯蓣皂苷、纤细薯蓣皂苷、重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅴ对照品，用甲醇溶解，配制成质量浓度分别为0334，0348，0267，0327，0362，0381，0361，0340 g·L-1的混合对照品母液，并逐级稀释。

24含量测定的方法学考察

241线性关系取混合对照品溶液母液，将母液逐级稀释，每个浓度混合对照品进样10 μL，在上述21项条件，以峰面积为纵坐标，以各重楼皂苷对照品的质量浓度为横坐标确定标准曲线。以信噪比S/N=10为基准，测得最低定量限，以信噪比S/N=3为基准，测得最低检测限。重楼皂苷Ⅶ、重楼皂苷H、重楼皂苷Ⅵ、重楼皂苷Ⅱ、薯蓣皂苷、纤细薯蓣皂苷、重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅴ 的线性回归方程、相关系数、线性范围、最低定量限和最低检测限，见表2。结果表明8种重楼皂苷有良好的线性范围和线性关系。

242精密度试验取混合对照品溶液，按照21项条件连续进样6次，重楼皂苷Ⅶ、重楼皂苷H、重楼皂苷Ⅵ、重楼皂苷Ⅱ、薯蓣皂苷、纤细薯蓣皂苷、重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅴ 色谱峰峰面积的RSD（n=6）分别为070%，080%，080%，10%，090%，070%，080%，090%，结果表明仪器精密度良好。

243重复性试验取重楼药材（批号431382120521010YC）粉末约05 g，平行6份，精密称定，用22项方法制备供试品溶液，按照21项条件分析，计算样品中重楼皂苷Ⅶ、重楼皂苷H、重楼皂苷Ⅵ、重楼皂苷Ⅱ、薯蓣皂苷、纤细薯蓣皂苷、重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅴ含量的RSD 分别为12%，095%，19%，22%，070%，054%，064%，14%，结果表明实验重复性良好。

244稳定性试验取供试品溶液（批号431382120521010YC）分别于0，2，4，8，16，24，48，72 h进样测定，供试品溶液中重楼皂苷Ⅶ、重楼皂苷H、重楼皂苷Ⅵ、重楼皂苷Ⅱ、薯蓣皂苷、纤细薯蓣皂苷、重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅴ的色谱峰峰面积的RSD （n=8） 分别为010%，050%，13%，090%，12%，060%，050%，060%，结果表明供试品溶液在3 d内稳定性良好。

245加样回收率试验取已知含量重楼药材粉末（批号431382120521010YC）约025 g×9，精密称定，按照相当于药材中重楼皂苷80%，100%，120% 的比例，分别精密加入混合对照品溶液25 mL， 同上供试品的制备方法，在上述的色谱条件下进行分析，计算重楼皂苷Ⅶ、重楼皂苷H、重楼皂苷Ⅵ、重楼皂苷Ⅱ、薯蓣皂苷、纤细薯蓣皂苷、重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅴ的回收率，回收率=（C-A）/B×100%，A为所用重楼药材中含被测成分的量，B为加入对照品量，C为混样的实测值，试验结果见表3。

25样品的含量测定

取不同来源和不同品种的重楼药材，按照23项方法制备供试品溶液，按照21项方法测定重楼皂苷Ⅶ、重楼皂苷H、重楼皂苷Ⅵ、重楼皂苷Ⅱ、薯蓣皂苷、纤细薯蓣皂苷、重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅴ 的含量见图2，表4。

3讨论

重楼皂苷的极性较大，结构相似，不易良好分离[16]。本实验考察了不同型号的色谱柱Waters HSS T3，Agilent ZORBAX SB C18，Thermo Syncronisa Q对重楼样品的分离效果，最终确定使用资生堂的CAPCELL PAK ADME 色谱柱。在实验过程中发现，柱温低较时，8种重楼皂苷的分离效果好，最终确定色谱柱柱温为21 ℃。

对各样品中的8种主要活性成分进行了定量分析。原来考虑将重楼皂苷D[17]和Tc[18]一块测定，但发现所有样品中除南重楼中含有大量重楼皂苷D外，其他样品中的重楼皂苷D和Tc的含量多低于定量下限，且分离效果不太理想，所以本次实验没有将两者统一测定。此次所测样品中有不少不符合2015年版《中国药典》规定的重楼皂苷Ⅶ， Ⅵ， Ⅱ， Ⅰ的总量大于06% 的要求。其中毛重楼、金线重楼和狭叶重楼中皂苷含量很低或幾乎没有，应该不能作为重楼入药。多数多叶重楼的皂苷含量也很低，但其中59和60样品的含量较高，可能受产地影响较大。南重楼中虽然药典规定4种皂苷含量较低，但8种总皂苷含量较高，有的不低于滇重楼。大理重楼、卵叶重楼、球药隔重楼、长柱重楼和五指莲，这几种重楼的皂苷含量基本符合药典要求，可以考虑作为替代资源进行研究开发。其中大理重楼，卵叶重楼和球药隔重楼以偏诺皂苷为主，而长柱重楼和五指莲主要以薯蓣皂苷为主。偏诺糖苷较薯蓣糖苷具有较好止血作用，薯蓣糖苷通常较偏诺糖苷具有很好的细胞毒活性[3，17]，从这方面考虑，不同品种的重楼在药理作用上可能存在差异，在临床上使用时应加以考虑。另外，本次实验的多数样品采集于云南，对其他产地的样品的代表性值得进一步商榷。

在测定结果中，同种重楼之间的含量差异也较大。滇重楼根据植株形态的差异，分为传统型、多叶型和大理型等多种，其中传统型的滇重楼薯蓣皂苷的含量较偏诺皂苷高，而大理型的主要以偏诺皂苷为主，这一现象值得深入研究。滇重楼地下根茎的皂苷含量在10月份达到最大值，但本研究所测的重楼样品大多采于5—8月份，因此部分样品甾体皂苷的量低于2015年版药典规定量（>06%），这可能与采收的季节以及重楼的生长年限有关[19]。在重楼药材中，各皂苷的含量差异较大，药典中同时测定重楼皂苷Ⅰ，Ⅱ，Ⅵ，Ⅶ的含量，虽然同时考虑了薯蓣类糖苷和偏诺类糖苷的含量，并不能很好的反应药材的品质，应将其中含量较高的纤细薯蓣皂苷、重楼皂苷Ⅴ、重楼皂苷H及薯蓣皂苷的含量考虑其中。本实验建立的HPLCUV含量测定方法，具有良好的精密度和重复性，能简单有效同时评价重楼属植物中多种皂苷类成分，便于定量评价及质量控制。

[致谢]重楼属植物采样和鉴定过程中得到了云南彝道农业发展有限公司、文山圣龙农业合作社、云南煜欣农林生物科技有限责任公司和中国科学院昆明植物研究所李恒研究员的帮助和支持。endprint

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[责任编辑丁广治]endprint