牛血清白蛋白及金属石墨烯复合材料与高藜芦胺对映体的选择性作用研究

冉佩瑶，宋金奕，夏 巧，马 骄，杨成成，傅英姿

(西南大学化学化工学院，重庆400715)

牛血清白蛋白及金属石墨烯复合材料与高藜芦胺对映体的选择性作用研究

冉佩瑶，宋金奕，夏 巧，马 骄，杨成成，傅英姿*

(西南大学化学化工学院，重庆400715)

利用还原氧化石墨烯、纳米铂和牛血清白蛋白复合材料(BSA/PtNPs/rGO)修饰玻碳电极，构建手性传感界面，并采用差分脉冲伏安法(DPV)研究该传感界面与手性药物合成前体高藜芦胺对映体(1-(4-甲氧基苯基)乙胺，MPEA)的相互作用。实验发现，在相同条件下，当MPEA对映体浓度小于2.25×10-3mol/L时，RMPEA在传感界面的电流响应信号明显大于S-MPEA；当MPEA对映体浓度大于2.25×10-3mol/L时，SMPEA的电流响应信号更强,即该传感界面可与MPEA对映体发生选择性作用。且在1.00×10-4mol/L至4.00×10-3mol/L浓度范围内，R-MPEA和S-MPEA的峰电流与其浓度呈线性响应。该传感器制备简单、响应快速、检测灵敏，在MPEA的选择性作用方面具有较大发展潜力。

选择性作用；电分析化学；金属石墨烯复合材料；牛血清白蛋白；1-(4-甲氧基苯基)乙胺

Abstract：A chiral sensing interface was fabricated by reduced graphene oxide,platinum nanoparticles(PtNPs/rGo)and bovine serum albumin(BSA).Differential pulse voltammetry(DPV)was used to investigate the stereoselectivity of sensing interface to homoveratrylamine enantiomers(1-(4-methoxyphenethyl)amine,MPEA).The result displayed that when the concentration was less than 2.25 mmol/L,R-MPEA got the larger signal compared with S-MPEA.When the concentration was exceeded 2.25 mmol/L,S-MPEA got the larger signal compared with R-MPEA.Besides,R-MPEA and S-MPEA presented a linear relationship in the range of 1.00 ×10-4mol/L to 4.00×10-3mol/L.This chiral sensor exist great potentials in selective action owing to its advantages of simple operation,rapid detection and sensitive response.

Key words:chiral recognition;electroanalytical chemistry;complex of metal and graphene;bovine serum albumin;1-(4-methoxyphenethyl)amine

0 引言

生命体是一个复杂的手性体系，维持身体运作的生物活性分子大多是手性分子，手性药物进入生物体后，会与体内分子进行严格的手性匹配，从而使得手性药物的不同构型在生物系统内的作用机制以及产生的药效和毒理性都有一定差异。当手性药物处于生物体中的手性环境时，不同的构型会具有不同的药效[1-2]。例如，R-反应停是一种缓解妊娠反应的药物，而S-反应停不仅没有疗效，反而具有致畸作用；D-青霉胺用于治疗肝豆状核变和威尔森氏症，并可作为中间体用于合成药物，而L-青霉胺则具有较强毒性和潜在的致癌活性[3]。因此，发展简单、快速、灵敏和可靠的手性药物对映体纯度分析和含量检测技术成为医药学和生物学等领域的研究热点。近年来，手性电化学传感器以其操作简单、灵敏度高和成本低等优点获得了广泛的关注[4-10]。

高血压是心、脑血管疾病的主要诱发因素之一，现已位于各种疾病引起死亡的第三位，被医学界称为人类的第一杀手。因此，降压药物的筛选及其开发研究具有重要现实意义。高藜芦胺(1-(4-甲氧基苯基)乙胺，MPEA)不仅降压作用明显，无快速耐受现象，具有与藜芦生物碱相似或相近的药理活性，而且也是维拉帕米、贝凡诺尔等心血管药物的合成前体[11-12]。目前为止，对于高藜芦胺对映体有效识别的研究工作并不充分。因此，发展快速有效的识别方法对高藜芦胺对映体进行识别具有巨大的实际应用价值。

石墨烯(graphene)是由碳原子以sp2杂化轨道组成的六角型呈蜂巢晶格平面薄膜结构的一种新型二维碳纳米材料，以其比表面面积大、导电性能好及稳定性高等优点，在电化学传感器的构建上得到大量应用[13-15]。为充分利用石墨烯的优良性能，对石墨烯的改性研究日益多样化，如在石墨烯表面原位还原K2PtCl6，提高石墨烯的电子传输能力。

牛血清白蛋白(BSA)是由583个氨基酸残基组成的多肽链，其中35个半胱氨酸组成17个二硫键，在肽链的34位有一个自由的巯基，其二级结构为高度的ɑ-螺旋结构，是一种天然的手性选择剂。BSA可与多种阳离子、阴离子和其他小分子物质结合，已成功地用于电化学手性传感器中。然而，由于蛋白质对氧化还原活性位点具有屏蔽作用，会阻碍电子传递而制约BSA的应用范围。因此，增加BSA与电极之间的电子传递速率是构建电化学传感器的关键。

该文使用还原氧化石墨烯和纳米铂进行复合，而后通过BSA在纳米铂表面自组装形成复合手性材料并修饰在玻碳电极表面(BSA/PtNPs/rGO/GCE)，构建手性电化学传感器。利用扫描电子显微镜(SEM)表征了修饰界面的表面形态，并用电化学方法研究了该手性界面与MPEA对映体的相互作用。

1 实验

1.1 试剂和仪器

高藜芦胺对映体(R-1-(4-甲氧基苯基)乙胺，R-MPEA,96%；S-1-(4-甲氧基苯基)乙胺，SMPEA,98%)购于百灵威试剂公司(中国，北京)，氧化石墨烯(GO)购于纳米先锋纳米材料科技有限公司(中国，南京)，六水氯铂酸和硼氢化钠购自Sigma Chemical Co.(St.Louis,MO,美国)，牛血清白蛋白(BSA,98%)购于百灵威试剂公司(中国北京)。工作缓冲溶液为0.10 mol/L磷酸缓冲溶液(PBS,pH7.4)制备的 5.00 ×10-3mol/L[Fe(CN)6]4-/3-溶液。其余化学试剂均为分析纯，无需进一步纯化即可直接使用，所有实验用水均为二次蒸馏水。

所有电化学测试均在CHI 440A电化学工作站(中国，上海辰华)上进行，标准三电极体系中，铂丝电极作为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，玻碳电极和修饰过的玻碳电极均为工作电极。扫描电子显微镜照片由扫描电子显微镜S-4800(SEM,日立，日本)测得。

1.2 金属石墨烯复合材料制备

首先，参照文献制备还原石墨烯和纳米铂复合材料[16-17]。具体操作如下：称取10.00 mg氧化石墨烯分散于10.00 mL蒸馏水中，超声半小时使其分散均匀。向上述溶液中加入1 mL浓度为2.12 mg/mL六水氯铂酸溶液。在持续搅拌条件下，缓慢滴加10.00 mL新制备的NaBH4(0.48 mol/L)溶液于混合溶液中，室温条件下持续搅拌24 h。溶液颜色由浅棕色变为黑色，即表明氧化石墨烯已被还原为还原石墨烯。然后将所制得的溶液离心，洗涤并晾干。所得产品标记为PtNPs/rGO。

1.3 生物选择性界面制备

裸玻碳电极(GCE,Φ=4 mm)分别用1.00、0.3和0.05 μm的Al2O3抛光粉打磨抛光，依次在乙醇和二次蒸馏水中超声清洗，除去Al2O3粉末，在空气中自然晾干;然后滴涂10.00 μL PtNPs/rGO纳米材料到干净的玻碳电极表面，室温下晾干。随后，再滴涂10.00 μL BSA于其上(BSA/PtNPs/rGO/GCE)，晾干备用。

2 结果分析与讨论

2.1 纳米材料表征

用SEM对GO、PtNPs/rGO和BSA/PtNPs/rGO材料进行了表征。从图1A可以看到氧化石墨烯(GO)表面有轻微皱褶;将H4PtCl6和GO混合还原后,可看到还原石墨烯片层上附着有大量的铂纳米颗粒(图1B);当滴涂了BSA之后，材料表面有一层薄薄的物质包裹其外（图1C）。同时使用了X-射线能谱(EDX)对材料的元素进行分析，如图1D所示，说明金属铂被成功地原位还原在石墨烯上。

图1 (A)GO,(B)PtNPs/rGO,(C)BSA/PtNPs/rGO的SEM形貌;(D)EDX图像Fig.1 SEM image of nanomaterials:(A)GO,(B)PtNPs/rGO,(C)PtNPs/rGO and BSA,(D)EDX of PtNPs/rGO complex

2.2 不同修饰界面的电化学响应

循环伏安法(CV)是研究电极表面特性的常用方法，实验中采用其研究了不同界面在5.00 mmol/L的[Fe(CN)6]4-/3-溶液(pH7.4)中的电化学行为(扫速0.10 V/s)。从图2中可以看出裸玻碳电极呈现一对对称的氧化还原峰 (曲线a)，而PtNPs/rGO修饰电极的峰电流比裸玻碳电极高(曲线b)，这是由于PtNPs/rGO纳米材料良好的电子传输能力所致；修饰上BSA之后，修饰电极的峰电流显著降低(曲线c)，这是由于BSA阻碍了电子的传输。

图2 不同修饰界面的电化学响应：(a)裸玻碳电极，(b)PtNPs/rGO，(c)BSA/PtNPs/rGOFig.2 The electrochemical response of different interfaces:(a)bare glassy carbon electrode,(b)PtNPs/rGO and(c)BSA/PtNPs/rGO

2.3 生物传感器界面与高藜芦胺的选择性作用

采用差分脉冲伏安法研究了修饰界面与MPEA 对映体（4.00×10-3mmol/L）的相互作用，测试底液为 5.00×10-3mol/L[Fe(CN)6]4-/3-(pH7.4)溶液。如图3所示，当BSA/PtNPs/rGO/GCE与R或S构型MPEA作用后，电流显著下降，且S构型MPEA(曲线a)的电流下降量大于R构型MPEA(曲线 b)，两者峰电流变化差(ΔI=ΔIR-ΔIS)为33 μA。

图3 传感界面对MPEA对映体的DPV响应:(a)SMPEA,(b)R-MPEAFig.3 Different pulse voltammetry of the chiral sensing interface to the(a)S-MPEA and(b)R-MPEA

产生这种现象的机理可能是：当BSA/PtNPs/rGO/GCE与R或S构型MPEA作用时，因蛋白质BSA的强阻碍电子性，导致电流响应信号降低；其中R构型MPEA比S构型更能使蛋白质多肽链伸展，破坏蛋白质空间结构，使BSA以一种更疏松的状态存在，有利于电子的传递[17],因此R构型电流响应强于S构型，由此产生了与对映体间的选择性作用。

图4 (a)S-MPEA和(b)R-MPEA在不同界面的DPV电流响应：(A)裸玻碳电极,(B)PtNPs/rGO/GCE,(C)BSA/PtNPs/rGO/GCEFig.4 DPV current response of(a)S-MPEA and(b)R-MPEA on different interfaces:(A)bare glassy carbon electrode,(B)PtNPs/rGO/GCE,(C)BSA/PtNPs/rGO/GCE

同时，研究了不同传感界面的电流响应情况。如图4所示，两种构型的MPEA对映体在裸玻碳电极(图A)和PtNPs/rGO修饰电极(图B)表面的电流响应信号无明显区别，说明这两种电极对MPEA异构体无识别作用；但MPEA对映体在PtNPs/rGO/GCE上的电流响应显著增强，说明PtNPs/rGO复合材料能够促进MPEA对映体在电极上的电子传递。当在PtNPs/rGO/GCE上固载了BSA后，两种构型的MPEA在电极表面的电流响应信号如图4C所示，S-MPEA(曲线a)和R-MPEA(曲线b)的电流响应均明显减小，说明BSA阻碍了MPEA在电极上的电子转移，且对两者的电子阻碍作用不同，表现为更利于R-MPEA在电极上的电子转移，因此R-MPEA的电流响应信号明显大于S-MPEA。实验结果表明，该传感界面对MPEA对映异构体有明显的识别作用。

2.4R-MPEA、S-MPEA浓度对选择性的影响

为研究该手性界面与R-MPEA及S-MPEA作用程度，测定了一系列不同浓度的MPEA对映体作用后的差分脉冲伏安测试。如图5所示，曲线 b为 BSA／PtNPs/rGO/GCE与浓度从 1.00×10-4mol/L到4.00×10-3mol/L的RMPEA作用后的峰电流的变化。从图中可看出，BSA/PtNPs/rGO/GCE与R-MPEA作用后的峰电流的变化均与浓度的增加成反比，线性方程为Ip=101.80-15.04cRMPEA(r=0.9960);当BSA/PtNPs/rGO/GCE与浓度从1.00×10-4mol/L 到 4.00×10-3mol/L S-MPEA 作用时(曲线a)，S-MPEA的电流响应大小与浓度的增加成正比，线性方程为：Ip=27.50+18.06cSMPEA(r=0.9961)。这可能是由于S-MPEA与BSA的键合作用比R-MPEA弱[17-18]，分子中苯环可随意转动，当浓度增大时，附着在BSA上的S-MPEA分子中苯环转动至同一平面的概率增大，从而有利于电子的传递。

图5 峰电流与MPEA对映体的响应关系：1×10-4mol/L～4.0 ×10-3mol/L,(a)S-MPEA,(b)R-MPEAFig.5 Response relationship between peak current and concentration of(a)S-MPEA and(b)R-MPEA:1×10-4mol/L～4.0 ×10-3mol/L

3 结论

实验通过BSA与PtNPs/rGO复合材料相互作用，在玻碳电极表面构建了一个简单可靠的手性传感界面，用电化学方法研究该界面与R-或S-MPEA的选择性研究。由于R-MPEA和SMPEA的空间结构不同，导致它们与BSA呈现不同的作用：低浓度时，手性表面与R-MPEA作用后峰电流降低比S-MPEA少；当MPEA对映体浓度增大至2.25×10-3mol/L以上时，该界面对SMPEA的电流响应比同浓度R-MPEA大，说明该传感界面在不同浓度与R-MPEA和S-MPEA具有不同的作用。低浓度时，R构型MPEA比S构型更能使蛋白质多肽链伸展，破坏蛋白质空间结构，有利于电子的传递；高浓度时，因为S-MPEA与BSA的键合作用比R-MPEA弱，分子中苯环可随意转动，当浓度增大时，附着在BSA上的SMPEA分子中苯环转动至同一平面的概率增大，从而有利于电子的传递。这为其它探讨手性药物或手性小分子与BSA的作用提供了有价值的理论数据基础。

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Study on BSA and metal/graphene complex for enantioselective interaction with homoveratrylamine enantiomers

Ran Pei-yao,Song Jin-yi,Xia Qiao,Ma Jiao,Yang Cheng-cheng,Fu Ying-zi*
(School of chemistry and chemical engineering,Southwest University,Chongqing 400715,China)

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