高选择性半胱氨酸荧光探针的合成及生物成像

杨志广， 冯灿灿， 彭 鹏， 武 文， 田明刚

(1.周口师范学院化学化工学院，河南周口 466001； 2.山东大学晶体材料国家重点实验室，山东济南 250100)

图1 探针C1结构式Fig.1 Structure of C1 probe

生物体内半胱氨酸(Cys)、高半胱氨酸(Hcy)、谷胱甘肽(GSH) 等许多含巯基生物分子在体内生理与病理过程中发挥着关键性作用。例如，人体中缺乏Cys会引起肝脏受伤、皮肤松弛、身体浮肿和毛发褪色等病症[1 - 3]；而Hcy含量的增高则会引起老年痴呆症、动脉硬化、神经中枢缺陷和骨质疏松等疾病[4 - 5]；GSH则与人体中的氧化还原动态平衡密切相关[6 - 7]。因此，定量、专一性检测细胞内生物巯基分子对于人体疾病的预防、诊断和治疗具有非常重要的指导意义。荧光分析法相对于高效液相色谱法[8]、电化学法[9]、质谱法[10]、毛细管电泳法[11]等检测方法，具有操作简单、选择性好、灵敏度高以及可视化观测等优点[12 - 14]，在检测生物巯基分子方面得到了广泛的关注和应用。

本文根据醛基与巯基、氨基官能团共同作用合成了一种新型的,利用醛基识别生物巯基分子的荧光探针C1，探针C1结构式如图1所示。该探针本身无荧光，与Cys作用后，荧光强度迅速增强且溶液颜色由无色变为深蓝色，实现了对Cys的专一性识别和裸眼检测。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

Bruker Advance 300型核磁共振谱仪(瑞士，布鲁克公司)；Nexus 670型红外光谱仪(美国，尼高力公司)；6510型Q-TOF质谱仪(美国，Agilent公司)；Cary50型紫外可见吸收光谱仪(美国，瓦利安公司)；HITACH F-4500型单光子荧光光谱仪(日本，日立公司)。

咔唑(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；N-溴代丁二酰亚胺(NBS)(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；4-乙酰氧基苯乙烯(分析纯，百灵威化学技术有限公司)；氨基酸(分析纯，日本株式会社生物试剂公司)。水为去离子水。

1.2 探针C1的合成与表征

1.2.19-乙基咔唑的合成将一定量的KOH粉末和咔唑加入到丙酮中，室温搅拌数小时后，加入含有1-溴乙烷的丙酮溶液，反应过夜。经水洗，过滤，乙醇重结晶等过程，得到白色的固体，产率：83%。1H NMR(300 MHz,CDCl3),δ(ppm):8.10(d,J=7.8 Hz,2H),7.39～7.44(m,4H),7.20～7.25(m,2H),4.36(q,J=7.2 Hz,2H),1.43(d,J=7.2 Hz,3H)。

1.2.23-甲酰基-9-乙基咔唑的合成在250 mL圆底烧瓶中，加入1.86 mL DMF，冷却至0 ℃，逐滴加入2.3 mL POC13，再加入溶有4.88 g 9-乙基咔唑(25 mmol)的CHC13溶液，加热回流20 h。蒸出CHC13，倒入水中，调节pH至7～8左右，用CH2Cl2进行萃取，用水、饱和NaCl溶液洗涤，无水MgSO4干燥过夜，过滤，蒸出溶剂，粗产品用石油醚∶乙酸乙酯(10∶1)作淋洗液，经柱色谱分离得到黄色固体，产率：87%。1H NMR(300 MHz,CDCl3):δ(ppm) 10.10(s,1H),8.61(s,1H),8.16(d,J=7.8 Hz,1H),8.01(dd,J1=8.4 Hz,J2=1.5 Hz,1H),7.47～7.57(m,3H),7.26～7.35(m,1H),4.40(q,J=7.2 Hz,2H),1.47(t,J=7.4 Hz,3H)。

1.2.33-甲酰基-6-溴-9-乙基咔唑的合成在100 mL三口烧瓶中，加入2.2 g 3-甲酰基-9-乙基咔唑(9.85 mmol)和60 mL CHC13∶HAc混合溶液(1∶1,V/V)，氩气保护下，加入1.9 g NBS(10.67 mmol)，室温搅拌反应20 h，倒入冰水中，用CH2Cl2进行萃取，水洗，无水MgSO4干燥过夜，过滤，蒸出溶剂，粗产品用石油醚∶乙酸乙酯(10∶1)作淋洗液，经柱色谱分离得到白色固体，产率：81%。1H NMR(300 MHz,CDCl3):δ(ppm) 10.10(s,1H),8.56(d,J=1.2 Hz,1H),8.27(d,J=1.8 Hz,1H),8.05(dd,J1=8.6 Hz,J2=1.5 Hz ,1H),7.62(dd,J1=8.7 Hz,J2=1.8 Hz,1H),7.49(d,J=8.4 Hz,1H),7.35(d,J=8.7 Hz,1H),4.4(q,J=7.3 Hz,2H),1.47(t,J=7.4 Hz,3H)。

1.2.4探针C1的合成在100 mL三口烧瓶中，加入0.9 g 3-甲酰基-6-溴-9-乙基咔唑(3 mmol)、33.67 mg乙酸钯(0.15 mmol)、91.31 mg三邻甲苯基膦(0.3 mmol)和30 mL DMF，室温搅拌30 min。然后加入0.91 mL 4-乙酰氧基苯乙烯(6 mmol)和1 mL三乙胺，氩气保护下，加热至120 ℃，反应3 d。倒入水中，再用CH2Cl2进行萃取，水洗，无水MgSO4干燥过夜，过滤，蒸出溶剂，粗产品用CH2Cl2作淋洗液，经柱色谱分离得到黄色固体，产率：35%。IR(cm-1):1 671(υC=O),1 755(υC=O)。1H NMR(300 MHz,DMSO-d6),δ(ppm):10.08(s,1H),8.80(d,J=1.2 Hz,1H),8.57(s,1H),8.02(dd,J=8.55 Hz,1H),7.79～7.83(m,2H),7.73(d,J=8.4 Hz,1H),7.64～7.69(m,2H),7.32～7.45(m,2H),7.14～7.18(m,2H),4.53(m,2H),2.29(s,3H),1.36(t,J=7.2 Hz,3H)。HRMS(m/z):C25H21NO3[M+H]+计算值为383.15，测定值为384.18。

2 结果与讨论

2.1 探针C1紫外吸收和滴定光谱分析

固定探针C1浓度为10 μmol/L，Cys浓度为0～1.0×10-3mol/L，激发波长为347 nm，在甲醇中进行吸收光谱紫外和荧光滴定实验。由图2(a)可知，随着Cys浓度的增加，探针C1的紫外吸收峰在347 nm左右逐渐消失，而在332 nm处有一新峰出现，蓝移15 nm左右，同时在346 nm和324 nm处各出现一个等吸收点(图2(a))，表明探针C1与Cys发生了反应，生成了一种新的物质。根据荧光滴定结果，探针C1本身没有荧光，荧光强度逐渐增强(图2(b))，当Cys浓度为600 μmol/L，荧光强度增强105倍，说明探针C1是一种良好的检测Cys荧光增强型探针。另外，探针C1在最大发射波长处的荧光强度与Cys的浓度存在一定的线性关系，线性范围为20～100 μmol/L，荧光检出限(S/N=3)[15]为5 μmol/L。

图2 探针C1的紫外吸收(a)和荧光滴定(b)光谱Fig.2 UV absorption(a) and fluorescence titration (b) spectra of probe C1

2.2 探针C1的选择性分析

固定探针C1的浓度为10 μmol/L，其它相关生物分析物浓度均为600 μmol/L，激发波长为347 nm。由图3可见，在甲醇中加入Cys后，探针C1的紫外最大吸收峰蓝移15 nm左右，荧光强度显著增强，而加入Hcy、GSH等其它生物分析物后，紫外吸收和荧光光谱几乎没有变化，说明探针C1对Cys具有较高的选择性。另外，在自然光下溶液颜色均为无色(图4(a))，但在紫外灯(λex=365 nm)下，只有加入Cys溶液颜色呈深蓝色(图4(b))，其它溶液颜色没有发生变化，表明探针C1可以作为检测Cys的裸眼探针。

图3 探针C1加入各种生物分析物前后的紫外吸收(a)和荧光(b)光谱Fig.3 UV absorption(a) and fluorescence(b) spectra of probe C1(10 μmol/L) in the presence of 60 equiv diverse bioanalytes

图4 探针C1加入各种生物分析物前后的自然光照片(a)和紫外灯下(λex=365 nm)照片(b)Fig.4 The photos of probe C1(10 μmol/L) in the absence and presence of 60 equiv diverse bioanalytes under natural light(a) and UV light(b)(λex=365 nm) From left to right,then from top to bottom:C1,Cys,Hcy,GSH,Arg,Asn,Asp,β -ala,DTT,Gln,Glu,Gly,His,Ile,L-ala,Leu,Lys,Met,NAC,Phe,Pro,Ser,Thr,Trp,Tyr,Val.

2.3 反应时间对体系荧光强度的影响

固定探针C1的浓度为10 μmol/L，Cys、Hcy和GSH的浓度均为600 μmol/L，激发波长为347 nm。由图5可见，在甲醇中加入Cys后，探针C1的荧光强度在1～10 min内显著增强并达到最大，随着时间的延长，荧光强度逐渐降低，但降低幅度较小。因此，探针C1与Cys的最佳反应时间为10 min。而探针C1本身以及与Hcy、GSH作用后的荧光强度很弱且在1 h内几乎保持不变，表明探针C1与Cys作用后生成的强荧光物质具有较高的光稳定性。

2.4 探针C1的细胞成像

将浓度为5 μmol/L的探针C1分子在37 ℃ 孵育细胞0.5 h，用PBS洗三遍。将接种好细胞的玻片用PBS洗三遍，室温下在5 μmol/L的C1溶液中染色0.5 h，用488 nm氩离子激光进行扫描，经滤色片滤色后收集探针分子成像的荧光信号。成像结果如图6所示，结果表明，探针C1具有较好的细胞渗透性，能进入活细胞，并且得到了清晰的蓝色荧光照片。

图5 反应时间对探针荧光强度的影响Fig.5 Effect of reaction time on fluorescence intensity of probe

图6 探针 C1的宽场成像Fig.6 Wide-field image of probe C1

3 结论

以咔唑为原料，利用亲核取代反应、Vilsmeier反应和Heck反应等简单的有机化学反应，合成了一个荧光增强型半胱氨酸探针，并通过核磁、质谱和红外光谱等对探针结构进行了表征。该探针具有合成简单、选择性好和光稳定性好等优点，对半胱氨酸具有高度的选择性，可进行裸眼分辨和活细胞成像，在生物医学领域具有广阔的应用前景。