藏红T共振瑞利散射光谱法测定保健食品中的透明质酸钠

韩志辉，张艳芳，杨耀群

(湖南省职业病防治院，长沙 410007)

藏红T共振瑞利散射光谱法测定保健食品中的透明质酸钠

韩志辉，张艳芳，杨耀群

(湖南省职业病防治院，长沙 410007)

建立藏红T共振瑞利散射光谱法测定保健食品中透明质酸钠的含量。在pH 5.00的Britton–Robinson缓冲介质中，藏红T与透明质酸钠反应形成化合物，使溶液共振瑞利散射急剧增强并产生相应的散射光谱，其最大散射峰位于335 nm，5.0×10–4mol/L藏红T溶液用量为0.70 mL，反应时间为15 min。透明质酸钠的质量浓度在0.06～3.0 mg/L范围内与共振瑞利散射增强程度成良好的线性关系，线性相关系数为0.999 2。方法检出限为19.8 μg/L，测定结果的相对标准偏差为3.36%～4.52%(n=6)，加标回收率为92.4%～103.0%。该方法灵敏度高、选择性好、操作简便，适用于保健食品中透明质酸钠的测定。

藏红T；透明质酸钠；共振瑞利散射；保健食品

透明质酸(hyaluronic acid，HA)又名玻璃酸，是由N-乙酰氨基葡糖和葡糖醛酸的双糖重复单元构成的黏多糖类物质。作为广泛存在于动物结缔组织内的天然成分，HA具有良好的保湿作用、皮肤损伤修复和预防作用、增稠性等。在医药方面，HA用于非甾体消炎药，关节炎治疗及眼科、心外科手术的辅助药品，在治疗烫伤、烧伤、冻伤及人造皮肤等方面有着独特的作用。将HA用于化妆品和保健食品中，能起到保护皮肤的作用，可保持皮肤滋润光滑，细腻柔嫩，富有弹性，具有防皱、抗皱、美容保健和恢复皮肤生理功能的作用。因此HA的定量测定在医学、药学和化妆品行业中均具有重要意义。

HA使用时常以钠盐(sodium hyaluronate，SH)的形式存在，目前HA常用的分析方法有免疫法［1–2］、分光光度法［3–5］、电化学分析法［6–8］等。免疫法操作较复杂，试剂成本高；光度法干扰较严重；电化学法分辨能力低；极谱法使用汞，而汞具有挥发性和毒性，易对环境和实验人员造成伤害。

共振瑞利散射(RRS)技术具有灵敏、简便、快速等特点，已广泛应用于生物大分子、无机离子和有机物的定性定量分析［9–12］。共振瑞利散射法已经应用于SH的测定［13–15］，但主要集中于测定人体血液、发酵液和化妆品中的SH。

笔者研究了藏红T(Safranine T，ST)与SH反应体系的共振瑞利散射特征，以及适宜的反应条件。实验发现，在pH 5.00的Britton–Robinson缓冲溶液中，ST阳离子通过静电引力和疏水作用力与SH反应，使共振瑞利散射显著增强，在335 nm和558 nm产生较大的散射峰，其中335 nm的散射最强，与SH浓度在一定范围内成正比，据此建立了采用共振瑞利散射技术测定保健食品中SH的新方法。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

荧光分光光度计：F97XP型，上海棱光技术有限公司，

pH计：雷磁PHSJ–5型，上海仪电科学仪器股份有限公司；

超级恒温箱：501型，上海实验仪器总厂；

紫外–可见分光光度计：T6型，北京普析通用仪器有限公司；

电子分析天平：AUW220D型，感量为0.01 mg，日本岛津公司；

SH标准品：1 g/瓶，美国Sigma公司；

SH标准溶液：1.00 g/L，准确称取SH标准品100.00 mg，用蒸馏水溶解并定容至100 mL，临用时稀释成10.0 mg/L的标准工作溶液；

SH葡萄糖酸锌口服液：北京海德润制药有限公司；

藏红T：50 g/瓶，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；

藏红 T 溶液：5.0×10–4mol/L，称取 0.175 g 藏红T，置于1 000 mL容量瓶中，用二次蒸馏水溶解并定容至标线，摇匀，备用；

Britton–Robinson缓冲溶液：pH 5.00；

实验用水为二次蒸馏水。

1.2 荧光分光光度计工作条件

狭缝宽度：10 nm；扫描速率：1 000 nm/min；扫描范围：200～800 nm。

1.3 样品处理方法

取SH口服液适量，摇匀。准确移取0.50 mL于100 mL容量瓶中，用二次蒸馏水定容至标线，摇匀。取上述溶液0.50 mL按照1.4实验方法测定溶液的散射光强度。

1.4 实验方法

取10 mL的比色管，依次加入1.00 mL Britton–Robinson缓冲溶液、0.70 mL藏红T溶液及一定量的SH标准溶液，混匀，以二次蒸馏水定容至标线，振荡、混匀，于室温下反应15 min。将溶液于荧光分光光度计上，设定发射波长与激发波长相等，在200～800 nm进行同步扫描，获得体系的共振瑞利散射光谱，于最大散射峰波长处测定溶液的散射光强度IRRS。取10 mL比色管，配制空白溶液，除不加SH标准溶液外，其余操作同标准溶液，测得试剂空白的散射光强度为I0，计算化合物的散射光强度ΔIRRS=IRRS–I0。以SH的质量浓度为横坐标，以ΔIRRS为纵坐标绘制标准工作曲线，计算回归方程。

2 结果与讨论

2.1 光谱特性

按1.4实验方法测得空白溶液及SH–ST体系的共振瑞利散射光谱图，见图1。由图1可知，空白溶液及SH溶液的共振瑞利散射强度很低，而当藏红T和SH共存时，通过静电引力和疏水作用力反应形成化合物，导致体系的共振瑞利散射强度急剧增强，在335 nm和558 nm出现两个强的散射峰，本实验选择335 nm为定量分析波长。

图1 ST–SH体系的共振瑞利散射光谱图

2.2 反应时间

室温下，按照1.4实验方法配制1.50 mg/L的SH标准溶液，混匀后测定其光散射强度。发现体系的共振瑞利散射强度在15～120 min内比较稳定，因此选择在试剂混合完毕15 min后进行测定。

2.3 缓冲体系及酸度

配制1.50 mg/L的SH标准溶液体系，比较了 Tris–HCl，Britton–Robinson，NaAc–HAc 3 种 缓冲体系对共振瑞利散射强度的影响，结果发现加入Britton–Robinson缓冲溶液时，体系的ΔIRRS最大且稳定，故选择Britton–Robinson缓冲溶液作为反应介质。配制不同pH值的Britton–Robinson缓冲溶液进行试验，结果见图2。

图2 酸度对RRS的影响

由图2可知，pH在4.5～5.5时，ΔI达到最大且趋于恒定；当pH＞5.5时，ΔI开始下降。

考察了pH 5.00的Britton–Robinson缓冲溶液用量的影响，结果表明，当缓冲溶液加入量为0.50～1.50 mL时ΔI稳定，实验选择加入1.00 mL pH 5.00的Britton–Robinson缓冲溶液。

2.4 藏红T溶液用量

设定波长为335 nm，试验了藏红T溶液的用量对共振瑞利散射的影响。分别取5.0×10–4mol/L藏红 T 溶液 0.40，0.50，0.60，0.70，0.80，0.90，1.00 mL，按1.4方法测定，结果见图3。由图3可知，藏红T溶液用量过少时，反应不完全，疏水性化合物的浓度较低，体系的共振瑞利散射强度较小；藏红T溶液用量过大，则空白值增大，ΔI反而降低；当藏红T溶液加入量在0.60～0.80 mL时，体系的ΔI最大且变化平缓。实验选择加入0.70 mL 5.0×10–4mol/L藏红T溶液。

图3 当藏红T溶液用量对RRS的影响

2.5 方法的选择性

在10 mL反应体系中加入10 mg SH，当测定相对误差在±5%之内时，共存离子的允许质量：K+，Na+(1 500 μg)；Ca2+，Mg2+，Ba2+，，Cl–，F–(1 000 μg)；，I–，(800 μg)；葡萄糖、果糖、赖氨酸、色氨酸、缬氨酸、苏氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸(800 μg)；亮氨酸、酪氨酸、异亮氨酸(500 μg)。由此可见，该方法对于测定SH具有较好的选择性。

2.6 线性范围与检出限

取6支10 mL比色管，均加入1.00 mL Britton–Robinson缓冲溶液、0.70 mL藏红T溶液，然后分别加入 0.00，0.50，1.00，1.50，2.00，3.00 mL SH 标准溶液，混匀。按照1.4方法分别测定溶液的散射光强度，按公式ΔIRRS=IRRS–I0计算化合物的散射光强度，以溶液的质量浓度X为横坐标、散射光强度Y为纵坐标绘制标准曲线，得线性回归方程为Y=222.7X– 4.490，相关系数r=0.999 2，线性范围为0.06～3.0 mg/L。按照 3s/k计算方法检出限 (s为空白标准偏差，k为回归方程斜率)，计算得方法的检出限为 19.8 μg/L。

2.7 精密度试验

取SH葡萄糖酸锌口服液样品，混匀，取6只100 mL容量瓶，分别准确加入0.50 mL样品，用二次蒸馏水定容至标线，摇匀。取上述溶液0.50 mL，按1.4方法测定溶液的散射光强度，由标准工作曲线计算样品中SH的质量浓度，结果见表1。由表1可知，测定结果的相对标准偏差为3.36%～4.52%，表明方法的精密度良好。

表1 精密度试验结果

2.8 加标回收试验

在SH葡萄糖酸锌口服液样品中加入一定量的SH标准溶液后，按照1.4方法进行测定，计算回收率，结果见表2。由表2可知，SH的回收率为92.4%～103.0%，表明方法的准确度较高。

表2 加标回收试验结果(n=3)

4 结语

建立了一种以藏红T作为探针测定SH的共振瑞利散射法，优化了反应条件。该方法灵敏度高，选择性好，具有较高的精密度和准确度 ，可用于保健食品中SH的测定。

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环保部发布4项土壤检测新标准涉微波消解和GC–MS

不久前，环保部发布了四项新的土壤检测新标准，主要涉及的仪器包括微波消解仪、分光光度计、气相色谱–质谱联用仪等。其中，HJ 832–2017 《土壤和沉积物 金属元素总量的消解 微波消解法》 是环保部发布的第二个土壤前处理的标准。

在近期发布的土壤详查实验室基本要求中，无机污染物检测实验室没有要求配备微波消解仪，但要求在质量控制实验室至少配备一台微波消解仪。

标准名称、编号如下。

(1)土壤和沉积物。HJ 832–2017 《金属元素总量的消解 微波消解法》，该方法适用于土壤和沉积物中砷、钡、铍、铋、镉、钴、铬、铜、汞、锰、镍、铅、锑、硒、铊、钒和锌等 17 种金属元素含量的消解。

(2)土壤和沉积物。HJ 833–2017 《硫化物的测定 亚甲基蓝分光光度法》，该方法适用于土壤和沉积物中硫化物的测定。当取样量为20 g时，方法检出限为0.04 mg/kg，检测限为 0.16 mg/kg。

(3)土壤和沉积物。HJ 834–2017 《半挥发性有机物的测定 气相色谱–质谱法》，该方法适用于土壤和沉积物中氯代烃类、邻苯二甲酸酯类、亚硝胺类、醚类、卤醚类、酮类、苯胺类、吡啶类、喹啉类、硝基芳香烃类、酚类包括硝基酚类、有机氯农药类、多环芳烃类等半挥发性有机物的筛查鉴定和定量分析，对于特定类别的化合物，应在此筛选基础上选用专属的分析方法测定。

(4)土壤和沉积物。HJ 835–2017 《有机氯农药的测定气相色谱–质谱法》，该方法适用于土壤和沉积物中23种有机氯农药的测定，目标物包括α-六六六、六氯苯、β-六六六、γ-六六六、δ-六六六、七氯、艾氏剂、环氧化七氯、α-氯丹、α-硫丹、γ-氯丹、狄氏剂、p，p-DDE、异狄氏剂、β-硫丹、p，p-DDD、硫丹硫酸酯、异狄氏剂醛、o，p-DDT、异狄氏剂酮，p，p-DDT、甲氧滴滴涕、灭蚁灵。

（中国分析计量网）

英特尔联手博世推出空气污染监测系统

博世空气质量微气候检测系统针对EPA“标准污染物”提供全面的空气质量微气候数据测量，其中包括颗粒物参数、一氧化碳、二氧化碳、一氧化氮、二氧化氮、二氧化硫和臭氧。此外，MCMS还提供温度、相对湿度、光(包括紫外线)、声音和压力的环境参数。尽管传统环境监测系统需要大型基础设施、巨大的投资和复杂的操作，但采用英特尔技术的博世MCMS提供了一个低成本高效益的监测系统，用于高效测量并管理空气质量。

博世空气质量微气候检测系统提供了智能数据，并能够实时分析环境空气质量，这些信息可以应用于社区。从合理分配拥堵区域的交通流量，到根据空气质量提供健身建议。在工业和工厂中，它有助于追踪排放情况，还可以对工作人员进行安全检查，以监督工厂排放满足合规要求。

在建筑工地，管理者能够及早发出预警信号并提高效率、改进工作条件。在住宅买卖中，MCMS可用来为房地产买家提供关键信息，还可以让地产商和建筑师能够提供环境空气质量的证据。精密设计的设备可承受恶劣的天气，并且具有无线和有线(Wi-Fi和3G)的远程监测。它还能够提供无线校准，不断调节传感器，使其生成高质量的环境数据。

博世空气质量微气候检测系统是由英特尔®物联网平台、用于边缘设备生命周期管理的Wind River® Helix Device Cloud，以及一个硬化的端到端安全解决方案提供支持。该解决方案使用了云分析、数据管理和可视化软件。它采用耐用、用户友好型设计，安全性要求与EPA标准内置高度一致，以保护来自所有设备的数据。为了能够轻松扩展到未来的5G网络及其它机器到机器的连接技术，英特尔与博世提供了低成本高效益的解决方案，使得城市能够广泛部署、扩大覆盖范围并进行优化。

（中国化工仪器网）

Determination of Sodium Hyaluronate in Health Food with Safranine T Resonance Rayleigh Scattering Method

Han Zhihui, Zhang Yanfang, Yang Yaoqun
(Hunan Institute of Occupational Diseases Prevention and Control, Changsha 410007, China)

A method was established for determining sodium hyaluronate in health food by safranine T resonance Rayleigh scattering method. In buffer medium of pH 5.00, a compound complex was formed between sodium hyaluronate and safranine T, great enhancement of the intensity of resonance Rayleigh scattering (RRS) and a new RRS spectrum were obtained with its maximum scattering peak at 335 nm. The dosage of 5.0×10–4mol/L safranine T was 0.70 mL, and the reaction time was 15 min. The concentration of sodium hyaluronate was linear with the intensity of RRS in the range of 0.06–3.0 mg/L, the linear correlation coefficient was 0.999 2. The detection limit of the method was 19.8μg/L. The relative standard deviation of the detection results was 3.36%–4.52%(n=6), and the recovery was 92.4%–103.0%. The method has advantages such as high sensitivity, high selectivity, simple operation, and it is suitable for the determination of total amounts of sodium hyaluronate in health food samples.

safranine T; sodium hyaluronate; resonance Rayleigh scattering; health food

O657.3

A

1008–6145(2017)05–0063–04

10.3969/j.issn.1008–6145.2017.05.016

联系人：韩志辉；E-mail: gwen3012@126.com

2017–07–12