草鱼鳃组织蛋白双向电泳技术的建立及优化

徐湛宁，李福贵，陈 杰，蒋霞云，邹曙明

(上海海洋大学农业部淡水水产种质资源重点实验室，上海 201306)

草鱼鳃组织蛋白双向电泳技术的建立及优化

徐湛宁，李福贵，陈 杰，蒋霞云，邹曙明

(上海海洋大学农业部淡水水产种质资源重点实验室，上海 201306)

为建立并优化草鱼鳃蛋白质组双向电泳的技术体系，实验将草鱼鳃经裂解处理后，通过固相pH梯度胶条进行一向等电聚焦和SDS聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳进行蛋白分离，对不同的裂解液配方、蛋白纯化方法、IPG胶条的分离范围、上样量和染色方法等进行了探索和优化，并应用lmage Master 2D Platinum 7.0软件对电泳图谱进行了分析。结果表明：采用裂解液中添加DTT来取代Tris和TBP、选择分离范围为pH4-7的IPG胶条和150 μg的主动水化上样，电泳结束后对凝胶进行硝酸银染色，获得了覆盖范围广、低背景、高分辨率、适合差异蛋白分析的双向电泳参考图谱。

草鱼(Ctenopharyngodonidella)；鳃蛋白质；双向电泳；蛋白质组学

Abstract：In order to establish and optimize the two-dimensional electrophoresis(2-DE) system for proteomic analysis on the gill of Grass carp (Ctenopharyngodonidella)，protein samples of grass carp gill were separated by lysis.Immobilized pH gradient(IPG) strips was used to perform isoelectric focusing electrophoresis(the first dimension),and sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE) served as the protein separation.By optimizing different lysate formulations and protein purification methods，different immobilized pH gradients(IPG) gel strips，as well as varied loading amount and staining methods were investigated.The proteins were successfully isolated from grass carp gill and were separated by 2-DE.Image Master 2D Platinum 7.0 analysis software was applied to analyze the 2-DE images.The results showed that the quality of 2-DE profiles was significantly improved by replacing Tris and TBP with DTT in lysis buffer，loading 150 μg samples on the pH 4-7 immobilized pH gradients (IPG) strips，and staining with silver nitrite.In consequence，Compared with other methods the 2D-gels profiles with wider pH molecular weight range，lower background noise，higher resolution and more applicable for variant analysis were obtained by using this method consequently.

Keywords：Ctenopharyngodonidella;gill protein;two-dimensional electrophoresis;proteomics

蛋白质组学(Proteomics)是对生物蛋白组(Proteome)的分析与检测，即对蛋白质的数量、性质、功能、蛋白质之间相互作用及其与疾病发生、发展的关系的研究，已成为当前生命科学研究的热门领域[1,2]。蛋白质组分析主要通过蛋白质混合物的分离和质谱分析(Massspectrometry)两步程序完成。

双向电泳技术(Two-dimensional electrophoresis，2-DE)作为蛋白质组学研究的核心技术之一，是以蛋白质等电点和分子大小的不同作为标准，将蛋白质从混合物中分离出来[3]，具有较高的分辨率和灵敏度的特点，目前已成为检测和分析复杂蛋白质组分的一种有效方法[1]。目前，蛋白质组学研究已逐渐延伸到食品科学及水产科学方面，但仍处于起步阶段[4-8]。已有关于西施舌(Coelomactraantiquate)鳃[9]、草鱼(Ctenopharyngodonidella)肾脏[10]、青鳉(Oryziaslatipes)肝脏[11]、中国明对虾(Fenneropenaeuschinensis)肌肉[12]、尼罗罗非鱼(Oreochromisniloticus)肌肉[13]、大菱鲆(Scophthalmusmaximus)表皮[14]等进行蛋白质双向电泳技术体系建立的研究。对于草鱼鳃蛋白质双向电泳体系的建立尚未见报道。

草鱼(Ctenopharyngodonidella)属于鲤形目(Cypriniformes)鲤科(Cyprinidae)草鱼属(Ctenopharyngodon)，具有快速生长，个体大，肉质肥嫩鲜美，肌间刺少等优点[15]，是我国主要的淡水鱼养殖种类之一。不同物种，不同组织的双向电泳体系所使用的条件存在较大差异[16]，本实验以草鱼为实验材料，为探究草鱼鳃蛋白质双向电泳技术体系的最佳条件，通过对不同裂解液配方、蛋白纯化方法、IPG胶条的分离范围、上样量和染色方法等条件进行探索，优化双向电泳体系的关键步骤，建立了草鱼鳃双向电泳参考图谱。目前有研究表明草鱼鳃在抗呼肠孤病毒免疫方面起着重要的作用[17]，并且当下缺乏鳃对低氧反应的分子机制了解，建立的双向电泳参考图谱可为后续抗病毒和低氧胁迫下草鱼鳃蛋白质组学研究提供技术支持，也为其它鱼类的鳃蛋白质组学研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验用草鱼取自上海海洋大学农业部团头鲂遗传育种中心。实验前将体重(20±2)g的草鱼置室内养殖缸中充气暂养3 d，水温21 ℃，使其适应实验室内养殖环境。在冰上快速取出鳃组织放入RNase free EP管中，液氮速冻并置于-80 ℃超低温冰箱保存备用。

1.2 试剂与仪器

IPG干胶条、IPG Buffer，2D Clean-up试剂盒购自美国GE公司；二硫苏糖醇(DTT)、CHAPS、乙二胺四乙酸(EDTA)、四甲基乙二胺(TEMED)、甲叉双丙烯酰胺、十二烷基硫酸钠(SDS)、琼脂糖、尿素、硫脲、丙烯酰胺、碘乙酰胺、过硫酸铵、甘氨酸，Bradford蛋白定量试剂盒购于上海生工生物工程有限公司。其他试剂均使用分析纯试剂。

Milli-Q Sythesis超纯水系统(上海瑞枫生物科技有限公司)；Smart Spec TM Plus分光光度计(美国Bio-Rad公司)；5180R台式高速大容量离心机(德国Eppendorf公司)；AUY220型电子分析天平(日本岛津公司)；Ettan IPG-phor II型等电聚焦电泳仪、Ettan DALT six垂直电泳系统(美国GE公司)；超声波破碎仪(上海比朗仪器制造有限公司)及 Bio-6000扫描仪(上海中晶科技有限公司)。

1.3 草鱼鳃组织蛋白的提取与纯化

取草鱼鳃250 mg，用研钵加液氮研磨成粉末状，将粉末分别加入1 mL含蛋白酶抑制剂的裂解液中，震荡摇匀后于冰上裂解10 min，再加入2%(v/v)IPG buffer和40 mmol/L DTT或10 mmol/L Tris、2 mmol/L TBP，震荡摇匀于冰上裂解10 min。裂解结束后于低温(4 ℃)离心机12 000 r/min，30 min取中上层澄清液，作为提取的草鱼鳃组织蛋白样品。其中裂解液试验了两种配方，配方Ⅰ：1 mL裂解液(7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、4%(w/v)CHAPS、2%(v/v)IPG buffer、10 mmol/L Tris、2 mmol/L TBP)加三种蛋白酶抑制剂各5 μL(蛋白酶、磷酸酶、PMSF)；配方Ⅱ：1 mL裂解液(7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、4%(w/v)CHAPS、2%(v/v)IPG buffer、40 mmol/L DTT)加三种蛋白酶抑制剂各5 μL(蛋白酶、磷酸酶、PMSF)。

蛋白质的纯化方法设2组对照，A：丙酮沉淀法，取200 μL上清液，加入4倍体积丙酮溶液(-20 ℃预冷1 h)，混匀，-20 ℃沉淀过夜。4 ℃离心(12 000 r/min，30 min)去上清，获得蛋白沉淀，用水化液冰上重新溶解蛋白，将其溶于1 mL加入0.28%(m/v)DTT和0.5%(v/v)IPG buffer缓冲液的硫脲水化缓冲液中，冰浴放置30 min，每隔10 min震荡30 s，4 ℃离心(12 000 r/min，10 min)，取上清液备用。B：2D Clean-up试剂盒法，将A中同体积上清液按照说明书操作，所得上清液备用。采用Bradford蛋白定量法，直接上样或分装后于-80 ℃保存备用。

1.4 第一向等电聚焦电泳

参照Ettan IPG-phor II型等电聚焦系统使用指南进行。将IPG干胶条从-20 ℃冰箱取出于室温放置30 min，IPG胶条分别使用pH3-10和pH4-7两种分离范围，胶条长度均为24 cm。取草鱼鳃蛋白样品，按照比例与水化上样缓冲液(7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、4%(m/v) CHAPS、2%(v/v)IPG、40 mmol/L DTT)混匀，将高压灭菌后干燥的滤纸小片置胶条槽两极，搭建除盐桥，从负极至正极方向线性加入样品，胶条胶面朝下，覆盖于样品液上，胶条表面加入1.5 mL矿物油防止样品水化过程中蒸发。等电聚焦电泳仪设置程序：温度：17 ℃；最大电流：50 μA；胶条数：3 gel；等电聚焦程序见表1。

表1 等电聚焦电泳程序Tab.1 The electrophoresis parameter ofisoelectric focusing

1.5 胶条的平衡

等电聚焦程序结束后，将胶条放入含有SDS平衡缓冲液Ⅰ(6 mol/L尿素、75 mmol/L Tris-HCl pH8.8、29.3%(v/v)甘油、2%(w/v)SDS、1%溴酚蓝储备液、1%DTT)的平衡管内，将其平放固定于脱色摇床上平衡14～15 min，一次平衡结束后，取出胶条于超纯水冲洗胶条表面后放入含有平衡缓冲液Ⅱ(6 mol/L尿素、75 mmol/L Tris-HCl pH8.8、29.3%(v/v)甘油、2%(w/v)SDS、1%溴酚蓝储备液、2.5%碘乙酰胺)的平衡管中，进行第二次平衡14～15 min。

1.6 SDS-PAGE垂直凝胶电泳(二向)

将平衡好的IPG胶条在1×电泳缓冲液中浸泡3 s，然后用镊子把胶条转移至凝胶上，用薄塑料板轻压胶条使其充分接触聚丙烯酰胺凝胶，加入含有溴酚蓝的低熔点琼脂糖密封液，保证胶条与凝胶之间没有气泡与缝隙，采用12.5%的均匀SDS-PAGE电泳分离胶进行二向电泳，电泳参数为起始功率2 W/gel，45 min后升至17 W/gel，直至溴酚蓝到达凝胶底部结束，运行温度设置为15 ℃。

1.7 染色

电泳结束后，从玻璃板中取出凝胶并对其进行正负极标记后，染色。

1.7.1 考马斯亮蓝G-250染色(每块凝胶需250 mL)

①固定液(10%乙酸、40%乙醇)中固定至少30 min；②放入染色液(8%硫酸铵，0.8%磷酸，20%甲醇，0.08%考马斯蓝G-250)过夜；③用水不断冲洗凝胶进行脱色。

1.7.2 硝酸银银染(每块凝胶需250 mL)

①固定(40%甲醇，10%乙酸)中固定30 min以上或者过夜；②水洗5 min；③30%乙醇洗2×20 min；④水洗6×5 min；⑤0.02%硫代硫酸钠洗1 min；⑥水洗3×20 s；⑦染色液(0.2% AgNO3，0.02%甲醛)润洗去除残留的硫代硫酸钠，再加入足量染色液反应20 min；⑧水洗3×20 s；⑨显影液(3%Na2CO3，0.05%甲醛，0.000 5%Na2S2O3)润洗去除残留的染色液后显色；⑩终止(5%醋酸)5 min；水洗20 s将胶保存在蒸馏水中。

1.8 图象扫描与软件分析

用Bio-6000透射扫描仪(上海中晶科技有限公司)对凝胶进行图像扫描，扫描参数：分辨率：300 dpi，扫描模式为灰阶、透射扫描。保存为TIF格式。用Image Master 2D Plattinum 7.0软件(美国GE公司)对扫描图像(每个样品3次重复)进行分析。

2 结果

2.1 不同裂解液配方和蛋白纯化方法的2-DE图谱

不同的裂解液配方对蛋白质的溶解和提取效果存在显著差异，为避免不必要的蛋白质损失，减少人为修饰对蛋白质的影响，降低样品的离子强度，蛋白质样本的制备程序须通过反复实验才能摸索到最优条件[18]。本实验采用2种不同的裂解液配方对蛋白的提取效果进行了比较(如图1)，蛋白纯化方式均为丙酮沉淀法。实验结果显示：采用DTT取代Tris和TBP的裂解液Ⅱ的蛋白得率和条带清晰度高于裂解液Ⅰ，可促进蛋白的溶解。

有效的蛋白纯化方法可以显著提高双向电泳图谱的质量，本实验使用上述优化所得的裂解液配方Ⅱ，对丙酮沉淀法和2D clean-up试剂盒法二种纯化方式对双向电泳图谱的影响进行比较。从图2-a中可以看出，丙酮法纯化蛋白质所得的双向电泳图谱在偏中性区域内存在一定的蛋白质丢失且横条纹稍多，蛋白点较少。利用Image Master 2D Platinum软件分析图像可获得286个蛋白点。2D clean-up试剂盒法纯化蛋白质所得的双向电泳图谱上(图2-b)蛋白点覆盖范围广且分辨率高，在酸性端和中性端的蛋白点数量均有所增加，利用软件分析获得了418个蛋白点，相比于丙酮法增加了132个蛋白点，蛋白点分离明显且恢复量较大。

(a)裂解液Ⅰ；(b)裂解液Ⅱ

(a)丙酮沉淀法；(b)2D clean-up试剂盒法

2.2 IPG胶条分离范围的选择

一向等电聚焦是根据被分离蛋白质组分间的等电点差异来进行，不同等电点的蛋白质以预制IPG胶条为载体迁移到其等电点(pI)的pH处。本研究采用最常用的pH 3～10和pH 4～7的IPG胶条(24 cm)对分离效果进行了比较。结果显示(图3)使用pH 3～10的胶条图谱(图3-a)分离效果不佳，在碱性区域蛋白点分布较少且水平拖尾现象严重，清晰可见的蛋白点不多；采用pH 4～7的IPG胶条图谱(图3-b)中蛋白点分布于整块凝胶且清晰，横条纹较少，蛋白质被有效分离。

2.3 不同上样量的优化

在一向等电聚焦中的蛋白样品上样量是影响双向电泳图谱结果的重要因素。本实验比较了100、150、200 μg三种不同上样量以获得进行双向电泳的最佳上样量，得到的双向电泳图谱如图4(a)(b)(c)所示。结果显示，当上样量为100 μg时，图谱(图4-a)上可以获得清晰的蛋白点，拖尾现象不明显，但蛋白点总体偏少。而上样量为150 μg时，图谱(图4-b)上获得的蛋白点多且清晰，边界分明，横条纹较少；上样量为200 μg时，图谱(图4-c)上获得的蛋白点多，但部分区域的蛋白点横条纹较多，在酸性端和碱性端模糊不清，蛋白点分离效果不佳。

(a)pH3-10；(b)pH4-7

图3 不同pH的IPG胶条所得的2-DE图谱
Fig.3 The 2-DE map of different pH IPG strips

(a)100 μg;(b)150 μg;(c)200 μg

2.4 不同染色方法的影响

不同的双向电泳凝胶染色方法对电泳图谱分辨率有着很大的影响，图谱分辨率的高低往往会干预后续蛋白点的分析与鉴定。本实验采用硝酸银染色法(以下简称“银染”)和考马斯亮蓝G-250染色法(以下简称“考染”)比较分析其对双向电泳图谱结果的影响。结果如图5所示，考染图谱(图5-a)横条纹较多，碱性端蛋白点较少，部分区域蛋白点没有被清晰分离或显色。多数低丰度蛋白点没有被清晰分离或显色；银染图谱(图5-b)蛋白点较多且比较清晰，蛋白点与凝胶背景的对比性较高，能较完整地表明全蛋白信息。

(a)考染；(b)银染

3 讨论

建立一套有效的、可重复的样品制备方法是双向电泳成功的关键因素，也是获得高质量电泳参考图谱的必要因素[18-19]。本实验通过向裂解液配方中添加DTT来取代Tris和TBP，获得了蛋白得率和条带清晰度高的图谱。DTT作为还原剂可以裂解蛋白质结构中的二硫键，使待分析的样本蛋白处于完全还原状态，使变性的蛋白质完全伸展促进溶解。在其他的裂解液固定成分中，尿素、硫脲、CHAPS、IPG buffer和三种蛋白酶抑制剂也起到很重要的作用，尿素和硫脲联用打开了蛋白的三维结构，显著增强裂解液的溶解能力；双性离子去垢剂CHAPS可溶解膜蛋白，从而解除蛋白之间的相互作用，降低样品的离子强度[14]。微量的IPG buffer加入有助于减少蛋白聚合的机率，增强蛋白质基质间的疏水作用，从而有助于蛋白充分溶解；蛋白酶、磷酸酶、PMSF为蛋白酶抑制剂，可抑制多种蛋白酶活性，防止蛋白质降解，保持蛋白的完整性。

蛋白质经裂解液裂解后，若样品未经纯化，其中的非蛋白质类杂质会影响等电聚焦过程，使电压无法升到最高值导致聚焦不完全，为防止蛋白样品丢失，减少杂质(如盐、去污剂、核酸、脂类等)残留污染对等电聚焦过程的影响[20]，进而获得蛋白点清晰、分辨率高的双向电泳参考图谱，本实验对比分析了丙酮沉淀法和2D clean-up试剂盒法两种蛋白纯化方式。结果发现丙酮沉淀法纯化后的蛋白点数明显减少，这与丙酮沉淀导致大量的蛋白质丢失有关，且丙酮与试管具有一定的亲和性，可能也会影响到本实验结果；而使用2D clean-up试剂盒纯化后的蛋白点数明显增加且分辨率高，这得益于其本身利用独特的沉淀剂和辅助沉淀剂，能有效定量沉淀样本蛋白质，并将干扰物质留在溶液中减少污染残留，与其他纯化方法比较，蛋白沉淀容易复溶，蛋白恢复量大，操作简单。据国外文献报道，Popovabutler等[21]对白纹伊蚊的刷状缘膜囊泡蛋白的研究和Laz等[22]对小鼠肝脏蛋白的研究中，均采用2D clean-up试剂盒纯化蛋白样品，并获得了高质量的双向电泳图谱。

不同生物所含蛋白质的等电点也各不相同，选择合适分离范围的IPG胶条是有效分离蛋白质的必要因素[23]。若IPG胶条的分离范围选择不合适，则会导致蛋白大量集中在某一区域而不易被分离，从而影响图谱质量。研究表明，生物中大多数蛋白的等电点介于pH4-8之间，使用pH3-10分离范围的胶条适于显示样品中大部分的蛋白质，但在电泳图谱中间偏酸性端区域内会有大量的蛋白点聚集，两端的蛋白点偏少，使得中间蛋白点的分辨率较低[22]，这样往往导致遗失具有重要生物功能的低丰度蛋白质，相较于窄pH范围的胶条虽然蛋白覆盖率没有宽胶条的广，但可以得到相对分辨率高的蛋白质点[24]。申欣等[9]对西施舌鳃蛋白和薛宝贵等[14]对大菱鲆表皮蛋白的研究中，均采用pH4-7的IPG胶条，所得的双向电泳图谱蛋白点清晰并且覆盖范围广，最终分析得到的生物信息也比较完整。结合本研究的结果，应进一步使用窄pH值范围胶条，以期能获得草鱼鳃蛋白最优的双向电泳图谱。

蛋白样品上样量能较大程度上影响双向电泳图谱蛋白点数和质量，是获得样本完整生物学信息的关键因素[25]。在蛋白上样量较低情况下往往会检测不到部分低丰度蛋白从而使蛋白点总体偏少，无法体现双向电泳图谱上的蛋白点完整性。在蛋白上样量较高情况下虽有利于检测到低丰度蛋白质；但上样量过多又会导致部分区域高丰度蛋白聚集或沉降，使得有些蛋白质点分离效果不明显，并且随着上样量的增加造成盐离子浓度偏大，从而影响等电聚焦的过程，造成横条纹和拖尾现象的出现[26]。因此需要找出最合适的蛋白样品上样量。本实验中蛋白样品上样量为150 μg时双向电泳图谱效果最佳，虽然蛋白点数与200 μg上样量相比时较少，但蛋白点更加清晰且避免了高丰度蛋白的影响，更适合于双向电泳图谱的分析。刘志远等[12]在中国明对虾(Litopenaeusvannamei)肌肉组织蛋白质双向电泳技术体系的建立实验中采用17 cm，pH4-7的IPG胶条对三个不同的上样量100 μg、120 μg、150 μg条件下的电泳情况进行了比较，结果发现较高上样量会使部分蛋白堆积，过低上样量使得部分低分度蛋白消失，因此选择上样量为120 μg的电泳图谱较好。与本实验相比过程相似，但具体的上样量不同可能与实验对象和采用的胶条大小不同有关，本实验中所采用的是24 cm的IPG胶条。

银染和考染是2种常用的凝胶染色方法，不同的染色方法灵敏度具有一定的差异，将很大程度上影响蛋白点的分析和检测[27]。就本实验两种方法对比而言：考马斯亮蓝G-250染色法存在灵敏度低、染色时间长、上样量较多等缺点，并且上样量增加将导致高丰度蛋白聚集而引起大量横条纹；银染法具有操作时间短、灵敏度高、背景清晰、横条纹较少等优点，总体上银染效果优于考染。秦慧等[28]对几种双向电泳凝胶染色方法进行了比较，指出银染的灵敏度高于考染，但同时也发现考染方法在蛋白点质谱鉴定方面兼容性比银染高，因此后续进行蛋白质点的分析时应选用银染法，而在进行质谱鉴定时应选用考染法。

本实验建立的草鱼鳃组织蛋白质双向电泳技术体系，相较于申欣等[9]建立的西施舌鳃蛋白质组的双向电泳体系，同样对鳃组织蛋白质的提取过程中裂解液成分、IPG胶条的分离范围、染色方法进行了优化。但本实验增加了蛋白裂解后的纯化过程来减少杂质，以此保证蛋白质的充分制备和良好的等电聚焦过程，优化后选择了易复溶，恢复量大，操作简单的2D clean-up试剂盒法，并对上样量进行了优化，合适的上样量可以获得更优的图谱效果。

综上所述，本实验建立的草鱼鳃组织蛋白质双向电泳技术体系：通过有较强裂解能力的蛋白样品制备液[7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、4%(w/v) CHAPS，2%(v/v)IPG buffer、40 mmol/L DTT和0.5%(v/v) 蛋白酶、磷酸酶、PMSF抑制剂]，结合2D clean-up试剂盒法提取草鱼鳃蛋白，使用24 cm pH 4～7的固相IPG胶条进行一向等电聚焦，主动水化上样150 μg，电泳结束后采用银染并扫描获取凝胶图谱。通过以上各步骤的优化，基本建立了草鱼鳃组织蛋白质双向电泳技术体系，该体系能够有效将草鱼鳃蛋白质充分分离，获得覆盖范围广和分辨率高的双向电泳图谱，为后续草鱼在抗病毒和低氧胁迫下鳃组织蛋白质差异化分析研究提供技术基础。

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Establishmentandoptimizationof2-DEtechniqueingillproteinofCtenopharyngodonidella

XU Zhan-ning，LI Fu-gui，CHEN Jie，JIANG Xia-yun，ZOU Shu-ming

(KeyLaboratoryofGeneticResourcesforFreshwaterAquacultureandFisheries，ShanghaiOceanUniversity，Shanghai201306，China)

2017-05-18；

2017-08-03

“十二五”国家863计划主题项目(2011AA100403)；上海高校知识服务平台(ZF1206)

徐湛宁(1993- )，男，硕士研究生，专业方向为水产动物遗传育种。E-mail：653054759@qq.com

邹曙明。E-mail:smzou@shou.edu.cn

S917.4

A

1000-6907-(2017)05-0014-07