锦鲤致病性维氏气单胞菌的分离、鉴定及药敏研究

杨昆明，党 瑞，谢志胜，马江霞，段成任，郭爱民，岳 城

(新疆农业大学动物医学学院，乌鲁木齐 830052)

锦鲤致病性维氏气单胞菌的分离、鉴定及药敏研究

杨昆明，党 瑞，谢志胜，马江霞，段成任，郭爱民，岳 城

(新疆农业大学动物医学学院，乌鲁木齐 830052)

新疆乌鲁木齐本地某养殖场锦鲤(Cyprinuscarpio)突然大批死亡，在排除寄生虫感染后，怀疑是由细菌引起。为明确引起锦鲤大批死亡的致病菌，本实验对病鱼肝脏、肠道、肾脏等组织进行细菌分离纯化。通过革兰氏染色、微量生理生化反应及分子生物学鉴定，成功分离出两株菌，命名为CK5和CK9。两株菌都为革兰氏阴性短杆菌，在30 ℃正常生长，能利用葡萄糖、乳糖、纤维二糖，并且V-P、明胶、水杨苷实验阳性；PCR扩增其gyrB基因并测序，BLAST比对后，两株菌与维氏气单胞菌(Aeromonasveronii)的同源性最高，分别为99.6%和99.0%，在系统发育树上与维氏气单胞菌聚为一枝。病理组织切片显示肝脏脂肪空泡变性，肾小管变性坏死。药敏实验结果表明CK5、CK9对庆大霉素、氧氟沙星、头孢噻肟、氨曲南、诺氟沙星等药物敏感，对万古霉素、克林霉素、苯唑西林耐药。

锦鲤(Cyprinuscarpio)；维氏气单胞菌(Aeromonasveronii)；分离；鉴定

Abstract：Recently,the large number ofC.carpiobreakout death was suspected to be caused by bacteria after eliminated the parasitic infection.In order to find the pathogenic bacteria which caused the death ofC.carpio,the liver,intestine,kidney and other tissues of sick fish were investigated by isolation and purification of bacteria.After gram staining micro physiological,biochemical reaction and molecular biological identification.Two bacteria CK5 and CK9 were separated successfully.Both bacterias were Gram negative bacillus as well as normal growth at 30 ℃.The experiment of lactose,glucose,cellobiose,glutin,ortho-hydroxybenzoic acid were positive.By amplified and sequenced gyrB,aligned sequences with GenBank that results showed the sequence at high homology (99.6% and 99.0%) withAeromonasveronii,phylogenetic tree also indicated with high degree confidenc.The histopathologic slide display liver axunge vacuolar degeneration and kidney tubules degenerative necrosis.CK5 and CK9 were sensitive to genta，icin，ofloxacin， cefotaxime，aztreonam，norfloxacin，whlie exhibited resistance vancomycin,clindamycin and oxacillin.

Keywords：Cyprinuscarpio;Aeromonasveronii;isolation;identification

锦鲤(Cyprinuscarpio)隶属于辐鳍鱼亚纲(Actinopterygii)鲤形目(Cypriniformes)鲤科(Cyprinidae)鲤鱼属(Cypriuus)[1]。由于养殖环境变化引起体色突变，通过长期的人工选育培养的杂交变异品种。因其在水中姿态优雅，体色绚丽，作为风水鱼被广大民众喜爱。随着新丝绸之路的发展，新疆观赏鱼产业蒸蒸日上，尤其是锦鲤产业，新疆繁殖的锦鲤不仅被本地民众所喜爱，而且远销国外。随着锦鲤养殖规模的不断扩大，养殖密度也随之加大，因养殖管理制度混乱，相关细菌病知识匮乏，导致锦鲤细菌病高发，大批鱼死亡，给鱼户造成巨大损失[2]。

近期乌鲁木齐某观赏鱼养殖场锦鲤大批死亡，为找到其原因，在排除寄生虫感染的情况下，怀疑是细菌病感染。通过细菌分离、纯化，从中得到两株优势菌。对优势菌进行了镜检、生理生化特性实验及药物敏感性实验，并进行了gyrB序列分析，构建进化树[3]。旨在丰富我国锦鲤细菌病病原研究资料，并为锦鲤细菌病的防治提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

患病锦鲤采集于新疆乌鲁木齐市某观赏鱼养殖场。健康1龄锦鲤(体长10～15 cm，体重120～140 g)同样选自该养殖场，在实验室饲养21 d确定健康后用于回归感染实验。

LB肉汤(LB Broth)、LB琼脂(LB Nutrient Agar)、Mueeller-Hinton(M-H)液体培养基购自青岛日水生物技术有限公司；细菌微量生化试验管、革兰氏染液、药敏纸片购自杭州天河微生物试剂有限公司；细菌gyrB通用引物、序列测定由上海生工生物工程服务有限责任公司提供；胶回收试剂盒购自OMEGA生物科技有限公司；质粒提取试剂盒购自全式金生物科技有限公司。

1.2 细菌的分离纯化

无菌条件下从鱼体表(溃疡处或鳞片基部)、腹腔液、肝脏、肠、肾等病灶处取样，在LB琼脂培养基上划线，30 ℃倒置培养14～16 h。挑取形态一致的单个优势菌落进行革兰氏染色并进行进一步的分离传代纯化培养。

1.3 细菌鉴定

接菌环灭菌挑取琼脂平板上单个菌落，经稀释、涂片、固定、染色后，显微镜油镜下观察菌体形态和颜色，镜检菌体单一后挑取单个菌落接种于Mueeller-Hinton(M-H)液体培养基，用培养的纯化细菌进行VP、硫化氢、明胶、葡萄糖、纤维二糖、乳糖、酒石酸盐、水杨苷等生理生化实验，实验结果参照相关文献进行分析[4]。

分离纯化的细菌接种于LB液体培养基中，于恒温摇床30 ℃培养14 h，以菌液为底物，进行菌液PCR。选用细菌的通用引物扩增gyrB，(正向BF:5′-ACAACTCCTACAAGGTCTCCG-3′；反向BR:5′-TCAGCAGCAGGGTACGGATGT-3′)。引物由上海生工有限责任公司合成。

PCR反应体系(25 μL)为：Super mix 12.5 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，底物2 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR反应条件为：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性40 s，54 ℃退火60 s，72 ℃延伸2 min，共35个循环；72 ℃再延伸10 min。

扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，连接转化并提取质粒，送往上海生工生物公司进行测序。将测序结果通过Blast比对，用MEGA6.0软件做多重比较并构建系统发育树。

1.4 致病菌药敏试验

吸取50 μL菌液均匀涂布于M-H琼脂培养基表面，用无菌镊子夹取药敏片以适当间隔距离粘贴于琼脂培养基表面，轻压药敏片，使之与培养基充分接触，倒置在恒温培养箱30℃培养16-24h后观察并测量抑菌圈直径，根据药敏纸片说明书，判断该菌对相应药物的敏感程度[5，6]。

1.5 病理组织切片

将健康鱼和患病鱼的肝脏、肠体完整切下并保存在4%福尔马林中，参照李钰等[7]的病理组织切片法，采用型号为LEICA RM2235手摇连续切片机进行切片，并对切片进行染色，对比病变内脏切片与健康内脏切片间组织的变化。

1.6 回感实验

挑取纯化后LB琼脂平板上的优势菌落，用无菌生理盐水稀释成密度为1×109、1×108、1×107、1×106、1×105cfu /mL的细菌悬浊液，腹部肌肉注射每尾0.5 mL，对照组锦鲤肌肉注射等量的无菌生理盐水，每组注射5尾，水温30 ℃，持续供氧，连续观察5 d，每天定时投喂，观察并记录试验鱼的病症及每天死亡数目，发现死鱼及时捞出，检查并记录其体表及内脏器官的病变情况，同时作细菌分离。

2 结果与分析

2.1 致病菌形态特征

从患病锦鲤的肝脏和肠道(明显病变)分离纯化得到两株优势菌，初步命名为CK5和CK9，经染色两株菌均为革兰氏阴性短杆菌，接种于LB固体培养基上，30 ℃培养14 h后，形成圆形、直径1～1.2 mm(微隆起)左右、光滑、边缘整齐、半透明、灰白色的菌落，与气单胞菌菌落形态描述相符[8,9]。

2.2 生理生化反应结果

CK5和CK9的生理生化反应显示能利用葡萄糖、乳糖、纤维二糖，并且V-P、明胶、水杨苷实验阳性，根据《伯杰氏细菌鉴定手册》鉴定[10]，均与维氏气单胞菌相似(表1)。

表1 分离菌的生理生化特性Tab.1 Physiology and biochemistry reaction of bacteriaisolated

注：“+”表示阳性反应，“-”表示阴性反应。

2.3 PCR鉴定及系统发育树的构建

凝胶电泳结果显示，菌株CK5和CK9 gyrB电泳条带长度为1 200 bp左右(图1)。将菌株的CK5、CK9 gyrB基因序列在NCBI上进行同源性比对，结果显示CK5株与江苏株(KR070961)的同源性为99.0%，CK9株与安徽株(FJ589032)的的同源性为99.6%；运用Mega 6.0建立系统发育树显示(图2)，以Acinetobacterbrisouii为外类群，CK5株与KR070961聚为一支，CK9株与FJ589032聚为一支。本实验两株菌综合以上结果，可鉴定为维氏气单胞菌。

图1 分离菌株gyrB基因扩增序列Fig.1 Isolated strain gyrB gene amplification

2.4 致病菌药敏试验

药敏试验结果显示(表2)，CK5对庆大霉素、头孢噻肟、氨曲南等药物高度敏感；CK9对氧氟沙星、氨曲南高度敏感；两者对阿米卡星、卡那霉素、四环素中度敏感；对链霉素、环丙沙星、哌拉西林、氨苄西林、克林霉素、万古霉素耐药。

2.5 病理组织切片

通过病理组织切片染色(图3)，可观察到正常肝脏细胞边缘整齐，呈多边形，细胞核在中间；而患病锦鲤病变肝脏炎性细胞浸润(A)，脂肪空泡变性(B)。正常肾脏细胞排列紧密，边界清晰，细胞核靠近基底，病变肾脏肾小管与基底膜脱离，肾间质有大量淋巴细胞和嗜酸性细胞浸润(C)；肾小管变性坏死(D)。

表2 病原菌的药敏试验结果Tab.2 A ntibiotic sensitivity test of pathogenic bacteria

注：(R)表示低度敏感或不敏感；(I)表示中度敏感；(S)表示高度敏感。

2.6 回感实验

注射致病菌后，多数鱼发病症状和自然发病症状相似，从死亡与濒临死亡的实验鱼肝脏、脾脏、肾脏及腹水处分离得到注射菌。对照组正常饮食，没有死亡现象。

3 讨论

3.1 新疆锦鲤产业的发展及维氏气单胞菌对观赏鱼的危害

随着一带一路的建设，新疆经济发展稳步提升，水产业发展也越来越好，观赏鱼养殖业潜力巨大。新疆本土观赏鱼以养殖锦鲤为主，但是养殖者对气单胞菌[2,5]、荧光假单胞菌[11]、鲍曼不动杆菌[12]、迟钝爱德华菌以及弗氏柠檬酸杆菌对锦鲤造成的病害关注度不高。目前学术方面对本地区养殖锦鲤的疾病报道少之又少，本实验为新疆地区锦鲤养殖过程中细菌病的防治及病原研究提供了基础资料，也为我国鱼类细菌病研究提供了科学资料。

图3 Ⅰ正常肝脏，Ⅱ病变肝脏，Ⅲ正常肾脏，Ⅳ病变肾脏
Fig. 3 Ⅰnormal liver,ⅡDiseased liver,ⅢNormal kidney,ⅣDiseased kidney
A肝脏炎性细胞浸润，B脂肪变性；C肾间质淋巴细胞和嗜酸性细胞浸润，D肾小管变性坏死

近几年，国内外对维氏气单胞菌造成水产养殖动物病害的报道明显增多，秦国民等[2]、毛海涛等[13]、姜娜等[14]均在锦鲤病变处分离出维氏气单胞菌；有学者报道从金鱼[15]、地图鱼[16]等诸多患病观赏鱼体内分离出维氏气单胞菌；国外学者等[17，18]也从患病鱼体分离出维氏气单胞菌。该菌是条件致病菌，当鱼体有损伤，自身抵抗力下降时菌体侵入鱼体并大量增殖，产生气溶素(aer)[19]、溶血素(hly)[20]、细胞兴奋性肠毒素(alt)[21]等众多毒力因子。从患病锦鲤体内分离得到维氏气单胞菌，这在新疆地区观赏鱼细菌性疾病研究中尚属首次。

表3 人工回感实验Tab.3 Artificial regression infection experiment

3.2 分离菌的结果鉴定

本研究从患病锦鲤肝脏、肠道分离得到CK5和CK9两株致病菌，经革兰氏染色、生理生化实验以及gyrB三种方法对两种菌进行鉴定。革兰氏染色鉴定所需时间短，但是不能鉴定到种；微量生理生化实验鉴定比较直接，但是此方法适用于种间的区分鉴定；gyrB通过PCR其高敏感性和高精确性可以将纯化的细菌鉴定到种。本实验结合以上三种方法对分离的两株菌进行鉴定，结果两株菌均为阴性短杆菌，生理生化反应显示能利用葡萄糖、乳糖、纤维二糖，并且V-P、明胶、水杨苷实验阳性，上述结果与《伯杰氏细菌鉴定手册》上维氏气单胞菌的生理生化特性相符。gyrB基因序列分析显示CK5与江苏株(KR070961)的同源性为99.0%，CK9与安徽株(FJ589032)的同源性为99.6%，综上鉴定结果可判断CK5和CK9均为维氏气单胞菌。

3.3 维氏气单胞菌药物敏感性分析

本实验药敏结果显示致病菌对庆大霉素、头孢三代和头孢四代以及氧氟沙星等药物敏感；而对链霉素、哌拉西林、氨苄西林、克林霉素、万毒霉素呈现出耐药的状态，此结果与姜娜等[14]、黎炯等[22]报道的维氏气单胞菌药敏结果基本相符，与周光等[23]报道的维氏气单胞菌的耐药性结果有少许不同，原因可能是周光实验菌体分离自不同生态位以及与本实验菌分离地区不同。

在水产养殖中细菌病的预防是关键，但治疗是个难题。据报道，细菌黏附接触物表面时会分泌纤维蛋白、脂质蛋白、多糖基质等物质将自己包裹，形成一层生物被膜(Biofilm)，阻碍抗生素的渗透，从而形成耐药屏障[24,25]。对于鱼类细菌病我们秉持着无病先防，有病早治，防重于治的原则，对养殖水体进行杀菌消毒，在鱼饵料中添加适量的抗生素是水产养殖中防控细菌病的主要措施之一。抗菌药物种类复杂多样，质量也参差不齐，要有针对性的选用抗生素来预防和治疗细菌性疾病，避免单用、滥用一类抗生素而使细菌产生耐药性。最重要的是要改善水产养殖环境，提高锦鲤的抗病与应激能力，从而保证锦鲤养殖业健康可持续的发展。

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Isolation,identificationandantibioticsensitivityofAeromonasveroniifromCyprinuscarpio

YANG Kun-ming,DANG Rui,XIE Zhi-sheng,MA Jiang-xia,DUAN Cheng-ren,GUO Ai-min,YUE Cheng

(CollegeofVeterinaryMedicine，XinjiangAgriculturalUniversity，Urumqi830052，China)

2017-04-25；

2017-07-23

国家自然科学基金项目(31360644)；自治区推广项目(2016C03013)；新疆农业大学研究生科研创新项目(XJAUGRI2016006)

杨昆明(1992- )男，硕士研究生，专业方向为水生动物保护学。E-mail：ykunming@aliyun.com

岳 城。E-mail：yuechengxnd@aliyun.com

S941.42

A

1000-6907-(2017)05-0047-06