波吉卵囊藻对重金属铬的耐受性研究

董龙香，程俊茗，胡 鲲，杨先乐

(上海海洋大学，国家水生动物病原库，上海 201306)

波吉卵囊藻对重金属铬的耐受性研究

董龙香，程俊茗，胡 鲲，杨先乐

(上海海洋大学，国家水生动物病原库，上海 201306)

为了研究波吉卵囊藻对重金属铬的耐受性，向波吉卵囊藻(Oocystisborgei)培养液中加入不同质量浓度的重铬酸钾，铬(Ⅵ)浓度依次为：0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0 mg/L。每天定时测定波吉卵囊藻藻细胞密度、叶绿素a含量以及藻蛋白含量。结果表明波吉卵囊藻在铬浓度≤5.0 mg/L时，随着培养时间的增长，藻细胞密度、叶绿素a含量和蛋白含量均增加，且高于空白对照组指标；波吉卵囊藻在铬离子浓度5.0～7.5 mg/L时，随着培养时间的增长，藻细胞密度增多，叶绿素a含量增加;铬离子浓度≤7.5 mg/L时，蛋白含量随着铬离子浓度的增加；也相应增加；波吉卵囊藻在铬离子浓度>10.0 mg/L时，随着培养时间的增长，藻细胞密度不变，叶绿素a含量与蛋白含量增加显著小于空白组。实验得出低浓度铬(Ⅵ)(≤5.0 mg/L)能够促进波吉卵囊藻生长，提高藻胆蛋白和叶绿素a含量，当铬(Ⅵ)浓度超过7.5 mg/L时，藻胆蛋白含量降低，波吉卵囊藻生长受到抑制，并且随着铬离子浓度的增加，抑制作用增大；总体而言，铬离子对波吉卵囊藻生长表现为双重作用，波吉卵囊藻对铬有一定的耐受性。

波吉卵囊藻(Oocystisborgei)；重金属铬；耐受性；生长影响

Abstract：In order to study the tolerance ofOocystisborgeito heavy metal chromium,different concentration chromium (Ⅵ) (0,2.5,5.0,7.5,10.0,12.5 and 15.0 mg/L)was added to the medium.The indexes are recorded,such asO.borgeicell density,chlorophyll content and algal protein content everyday to explore the tolerance ofO.borgeito heavy metal chromium.The results showed that,when the chromium (Ⅵ) concentration under 5.0 mg/L,the indexes of algal density,chlorophyll content and protein content ofO.borgeiincreased with the increase of chromium (Ⅵ) concentration.When the concentration of chromium (Ⅵ) was 0.5～7.5 mg/L,the density of algal cells and the content of chlorophyll were all increased,.When the concentration of chromium (Ⅵ) was under 7.5 mg/L,the protein content ofO.borgeiincreased with the increase of chromium (Ⅵ) concentration.When the concentration of chromium (Ⅵ) was over 10.0 mg/L,the activity ofO.borgeiincreased with the increase of chromium (Ⅵ) culture (less than 5.0 mg/L),the growth ofO.borgeiwas promoted and the content of phycobiliprotein and chlorophyll was increased.The concentration of chlorophyll and protein increased significantly.When the concentration of chromium (Ⅵ) exceeds 7.5 mg/L,the content of phycobiliprotein decreased,the growth ofO.borgeiwas inhibited,and the inhibitory effect increased with the increase of chromium concentration.The low concentration of chromium (Ⅵ) (less than 5.0 mg/L) promoteO.borgeigrowth,improve theO.borgeiprotein and the content of chlorophyll,when the concentration of chromium (Ⅵ) is more than 7.5 mg/L,theO.borgeiprotein content is decreased,O.borgeigrowth is restrained,and with the increase of chromium concentration,the inhibition increase；For conclusion,chromium ion have two-sidedness to theO.borgeigrowth,O.borgeihas a certain tolerance to chromium.

Keywords：Oocystisborgei；chromium；tolerance；growth affect

由于重金属等的污染日益加剧，水资源安全每况愈下，铬污染是重金属污染中危害最大的污染之一，对土壤[1]、水域[2]、植物[3]、水产动植物均存在不同程度的影响及其潜在的危害，且水体中铬极易富集于藻体中，尤其对微藻胁迫效应。高铬引起斜生栅藻(Scenedesmusobliquus)放氧速率骤降、细胞内CAT和T-AOC酶活升高、光合效率下降等影响[4]，黑藻(Hydrillaverticillata)在高铬(Ⅵ)下叶绿素被破坏含量减少[5]；小球藻(Chlorellasp.)在高铬存在下光合作用下降、产生严重的氧化损伤胁迫反应[6]；铬在16 μg/L时菱形硅藻(Nitzschia)和隐藻(Cryptomonasrostrata)生长显著受抑制[7]；重金属铬对藻类毒害作用六价铬最高，主要破坏叶绿素合成及其积累、激活甚至破坏藻细胞氧化酶、进而阻碍藻类光合反应过程，影响藻类生长。胡韧等[8]研究了Cr3+和Cr6+及其复合物对狐尾藻(Myriophyllumspicatum)的毒害作用，魏群等[9]的研究表明铬对五种藻类均有不同程度的毒害作用。而对铬的去除已有众多研究，包括吸附法、化学去除法及利用农林废弃品等环保节约材料去除法，如改性核桃壳为基准材料处理含Cr(VI)废水的效果[10]，生物吸附法尤其藻类植物去除重金属法得到众多研究者青睐。

波吉卵囊藻(Oocystisborgei)属于绿藻门卵囊藻属，为单细胞或群体，群体中一般由2、4、8、16个等偶数的细胞共同组成，外层由部分胶化膨大的母细胞包被而成；细胞为卵形、椭圆形、长圆形、柱状长圆形等近圆形几何形态，胞壁平滑或两端不规则增厚[11]。波吉卵囊藻在水产养殖实践上的良好使用反响与其巨大的潜在应用价值，使得对其研究日渐深入和重视。

如今规模化、集约化、高密度养殖模式逐渐成为对虾养殖的发展主流，而对水质的健康调节及优质水质的渴求是每个养殖者的热切需求。养虾先养水，波吉卵囊藻在对虾养殖中有改善养殖水质和增强对虾抗病力的作用[12]。波吉卵囊藻生长较稳定，生长速度较小球藻等藻类生长速度缓慢，且生长周期偏长，具有在前3～4 d藻细胞浓度增长缓慢，一周后仍持续生长的特点，可长期保持良好的水色藻类种群，保证对虾的健康生长[13]，达到增产增效的效果。国内对波吉卵囊藻的首次研究始于2002年，从对虾高位池中分离出来，进一步对其进行生长性能等方面的实验研究[12,14]，波吉卵囊藻逐渐为广大的水产养殖从业者所认识。波吉卵囊藻在对虾养殖方面崭露头角的同时，也愈发显现在对虾工厂化及其露天养殖中的优点。研究表明，波吉卵囊藻可有效去除养殖对虾水体中的氨氮和亚硝酸盐，改善水质以促进对虾的健康生长[11,15]。藻类生长过程中，受多种因素影响，重金属是影响藻类健康生长的重要因素之一。目前对重金属的影响研究主要集中在波吉卵囊藻对铜锌的吸附研究[16]，以及铁离子对同为卵囊藻属内的单生卵囊藻的细胞组成的影响[17]。重金属铬对波吉卵囊藻的影响有待进一步实验探究，确定波吉卵囊藻对铬(Ⅵ)的耐受性范围，亦为波吉卵囊藻吸附处理含铬离子废水的理论基础与实践应用提供重要的参考价值与科学依据。

在众多含铬物质中，六价铬的毒性最强，对人和动植物危害最大，因此，本研究选择重铬酸钾进行实验，研究六价铬离子对波吉卵囊藻生长的影响，及确定藻对铬(Ⅵ)的耐受性。从各个指标研究了铬(Ⅵ)对波吉卵囊藻的毒性效应，铬对藻生长的影响及其耐受性，为波吉卵囊藻的基础研究及实践应用提供理论依据和指导作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 藻种来源及其培养方法

波吉卵囊藻藻种由广东海洋大学藻类实验室黄翔鹄教授提供。藻种采用湛水-107-13培养液[18]进行培养。培养基配方如表1。

表1 波吉卵囊藻培养基(湛水-107-13培养液)Tab.1 Basic culture medium of O.borgei

1.1.2 实验用海水

实验所用海水均取自上海临港东海海水，经过沉淀砂滤、滤纸抽滤，121 ℃、15min 高压蒸汽灭菌后静置待用。

1.1.3 仪器药品

表2显示了部分仪器和药品来源。

表2 实验仪器和试剂Tab.2 Instruments and reagents of experiment

1.2 实验方法

1.2.1 藻类培养

实验所用藻种为处于对数期的波吉卵囊藻藻种，藻液∶培养液=1∶2。参照郑莲等[19]对波吉卵囊藻的研究实验方法进行培养。培养用药品均经过高压蒸汽灭菌，培养用具均用75%乙醇消毒，实验操作于无菌操作台内进行。

藻种培养用1 000 mL锥形瓶，培养体积为600 mL；实验用锥形瓶为250 mL中加入150 mL培养液。藻液锥形瓶均用带有滤膜的封口膜封口，以保证藻类生长所需无菌空气进出的流畅，并且每隔4 h充分摇匀一次。

1.2.2 藻类标准曲线

将已培养的藻液进行梯度稀释，分别对稀释后的藻液进行血球计数板计数以及对应的吸光值测定。其中吸光值通过723分光光度计在660 nm处的OD值测定来确定，空白对照为不加藻种的培养液。结果表明藻类个数与吸光值一定程度上线性关系良好，如图1所示，藻细胞OD值(660 nm处)-藻细胞密度之间线性标准曲线公式为：y=25.56x+0.490,其中，y：藻细胞浓度值，x：藻细胞在660 nm处OD值。

图1 波吉卵囊藻标准曲线Fig.1 Standard curve of O.borgei

1.2.3 数据处理

增值率K=(lgODt-lgOD0)/T×3.322。其中，ODt=培养后光密度值，OD0=初始光密度值，T=培养时间[20]。

1.2.4 藻细胞浓度测定

将培养后的藻液放于光照培养摇床中120 r/min摇匀20 min，利用DU-730紫外分光光度计测定藻液在660 nm处的吸光值，根据藻细胞OD值-藻细胞密度标准曲线，最终确定藻细胞密度。

1.2.5 叶绿素a含量测定

叶绿素a的测定参考文献[21]，根据李慧敏等[22]方法的测定。即取 10 mL波吉卵囊藻藻液，在 4 000 r/min 转速下离心 15 min，弃去其上清液，然后再加入10 mL的体积分数 90%的甲醇，振荡混匀。并将混匀的溶液于 4 ℃下黑暗萃取 6～8 h，重复离心 15 min，取其上清液，在分光光度计下测定其在 665 nm 处的吸光度值，并根据下列公式计算波吉卵囊藻藻体中叶绿素 a 的含量，依据以下公式进行计算[21]。公式如下：

C=13.9×OD665 nm

式中C代表叶绿素a的含量，单位为mg/L，OD665 nm代表藻液在 665 nm 处的吸光度值。

1.2.6 藻可溶性蛋白含量的测定方法

取10 mL波吉卵囊藻藻液于4 000 r/min离心15 min后弃去上清液，离心沉淀的藻细胞中加入0.05 mol/L 的 PBS(pH6.8)10.0 mL于浓缩的藻细胞中，并将两者混合均匀后 4 000 r/min 转速下离心 15 min，上清液用于藻蛋白含量的测定，采用南京建成生物工程有限公司蛋白试剂盒测定总可溶性蛋白质量浓度(g/L)。

计算公式：藻蛋白含量(g/L)=(ODx-OD0/ODs-OD0)×0.563(g/L)。其中，ODx=藻类样品OD值，OD0=空白对照值，ODs=标准品OD值，通过考马斯亮蓝方法进行测定。

1.3 铬离子对波吉卵囊藻生长影响

首先，预实验确定重铬酸钾的质量浓度范围，预实验中，重铬酸钾铬离子浓度范围分别为0.001、0.01、0.1、1.0、10、50、100 、200、300、400、500 mg/L，以不添加Cr(Ⅵ)作对照，每个实验组加入的藻类尽量初始OD值相等，每组两个平行，每天早上8:00～9:00定时测定藻密度，最终确定重铬酸钾铬离子浓度为1～10 mg/L之间。

重金属铬对波吉卵囊藻的生长影响实验中，重铬酸钾中铬离子质量浓度分别为2.5、5.0、7.5、10、12.5、15.0 mg/L，每个实验组设两个平行，以不添加铬的相同藻液作为对照组。

2 实验结果

2.1 不同铬离子生长条件下的藻细胞浓度

波吉卵囊藻在不同铬(Ⅵ)浓度条件下的生长情况见图2，图中可以总结出波吉卵囊藻生长经历适应期、缓慢生长期、对数生长期及平衡期，即培养前4 d，波吉卵囊藻生长速度较缓慢(P>0.05)；随着培养天数的增加，铬离子较低浓度(0～5 mg/L)下，波吉卵囊藻生长较快，且生长速度大于没有添加铬的空白对照组；当铬离子浓度5.0～7.5 mg/L时，波吉卵囊藻的生长相对缓慢，生长速度略小于对照组(P>0.05)；当铬离子浓度大于7.5 mg/L时，波吉卵囊藻藻密度减少，显著低于对照组(P<0.01)。当波吉卵囊藻培养至10 d后，总体藻类的藻细胞浓度上升迟缓，藻细胞生长速度下降；高浓度铬离子(>7.5 mg/L)时，藻细胞浓度减少。培养12 d的波吉卵囊藻在铬浓度为5.0 mg/L时，藻细胞密度最大，在铬浓度最大量15.0 mg/L时藻含量最小。

图2 不同铬浓度条件下波吉卵囊藻藻细胞密度Fig.2 Cells density of O.borgei under various Cr6+ concentrations

2.2 不同铬离子生长条件下的叶绿素含量

图3显示的是连续培养12 d，不同浓度铬离子下的每天测定的叶绿素a含量，总体趋势为叶绿素a含量不同程度有所增加，具体表现为：铬离子浓度在0～5.0 mg/L时，随着铬离子浓度的增加，叶绿素含量增加，且铬离子在2.5 mg/L和5.0 mg/L两个浓度下，培养12 d后的叶绿素含量高于对照组叶绿素含量，在铬离子浓度高于12.5 mg/L时，叶绿素含量基本没有增加(P>0.05)；培养12 d后的叶绿素含量从高到低对应的铬离子浓度实验组依次为：Cr6+(5.0 mg/L)>Cr6+(2.5mg/L)>Cr6+(0 mg/L)>Cr6+(7.5 mg/L)>Cr6+(10.0 mg/L)>Cr6+(12.5 mg/L)>Cr6+(15.0 mg/L)。

图3 不同铬浓度条件下波吉卵囊藻叶绿素含量Fig.3 Chlorophyll content of O.borgei under various Cr6+ concentrations

2.3 不同铬离子生长条件下的藻蛋白含量

从图4中可以看到，波吉卵囊藻连续培养12 d，不同浓度铬离子下的每天测定的蛋白质含量。具体表现为：铬离子浓度在≤7.5 mg/L时，随着铬离子浓度的增加，蛋白质含量增加，且铬离子在2.5 mg/L和5.0 mg/L两个浓度下，培养12 d后的蛋白质含量高于对照组蛋白质含量(P<0.05)，在铬离子浓度高于7.5 mg/L时，培养12 d后的蛋白质含量显著高于对照组蛋白质含量(P<0.01),且在此浓度下藻蛋白含量达到最高值；当铬离子浓度大于7.5 mg/L时，蛋白质含量显著下降(P<0.01)；培养液中铬离子浓度添加量增加到10.0 mg/L时，藻蛋白含量显著(P<0.05)低于空白对照组的藻蛋白含量，且随着铬离子浓度增加，藻蛋白含量不断下降，铬离子浓度为最大15.0 mg/L时，藻蛋白含量达到最低值。培养12 d后的蛋白质含量从高到低对应的铬离子浓度实验组依次为：Cr6+(7.5 mg/L)>Cr6+(5.0 mg/L)>Cr6+(2.5 mg/L)>Cr6+(0 mg/L)>Cr6+(10.0 mg/L)>Cr6+(12.5 mg/L)>Cr6+(15.0 mg/L)。

图4 不同铬浓度条件下波吉卵囊藻蛋白质含量(μg)Fig.4 Content of protein of O.borgei under various Cr6+ concentrations(μg)

3 讨论

通过对波吉卵囊藻藻细胞密度、蛋白含量、叶绿素含量的指标测定，数据处理与结果分析总结得出铬离子(Ⅵ)对波吉卵囊藻生长的影响总体表现为双重作用，即低浓度下促进藻类的生长，但当铬离子达到一定的浓度后，逐渐表现为抑制作用。铬离子浓度越高，抑制作用越强，直到完全抑制藻类生长，甚至引起波吉卵囊藻藻细胞的死亡。胡韧等在Cr3+和Cr6+及其复合物对狐尾藻的毒害研究中发现，低浓度(<1 mg/L)促进生长，高于一定浓度(>1 mg/L)则抑制藻的生长。张少斌等[13]的研究发现，铬离子对螺旋藻藻胆蛋白的影响表现为双重作用，具体表现为：低浓度铬离子(< 10 mg/L)能促进螺旋藻藻胆蛋白含量的积累，对螺旋藻的生长有一定的促进作用；但当铬离子浓度大于10 mg/L时，螺旋藻藻胆蛋白含量明显减少，螺旋藻生长受到较强的抑制作用。黄翔鹄等[16]研究过波吉卵囊藻对重金属铜和锌的耐受性作用，发现重金属铜和锌均对波吉卵囊藻表现为低促高抑作用，当铜含量在0.001 mg/L时，明显促进藻类生质，0.01～0.1 mg/L时，表现为轻微的抑制，当铜含量高于1 mg/L时，显著抑制波吉卵囊藻生长，10 mg/L时完全抑制其生长；波吉卵囊藻对重金属锌的耐受性是对铜的耐受性的10倍之多，即当锌为0.01 mg/L时促进藻细胞生长，当浓度在0.1 mg/L时，表现为轻度抑制，当锌浓度在10 mg/L时则抑制程度较高(抑制率=41.78%)，当锌含量到达较高浓度100 mg/L时，明显超出波吉卵囊藻藻细胞耐受范围，部分藻细胞开始死亡。而波吉卵囊藻对重金属铬的耐受性显著大于铜，藻对铬的耐受性大小与锌的作用范围相近，总体而言波吉卵囊藻对重金属铬具有较高的耐受性。

红藻门、褐藻门和绿藻门对重金属有一定的吸附性，常用于重金属的吸附。重金属与藻细胞结合是重金属对藻类产生抑制或促进的前提，而藻类能否吸附重金属关键在于藻类细胞壁的存在与否及其成分组成。藻类细胞壁骨架一般是以纤维素微纤丝或木糖醇、甘露聚糖组成，与蛋白质结合成糖蛋白，丰富的多糖细胞质基质使得藻类具有较好的金属结合能力[23]，而糖蛋白则是重金属的结合位点；藻类结合重金属的功能基团主要包括醇酮等含氧官能团、氨基等含氮硫基团和磷酸盐等[24]，除此之外，藻类能否吸附重金属还需考虑到共价交联、空间位阻和相应的构象变化等因素，并且不同吸附条件下会有不同的吸附效果，不适的条件甚至阻断金属离子的吸附[25]。

一般而言，金属阳离子更易短时间内附着在藻细胞细胞壁上[9]；除此之外，重金属对藻类作用的差异受多种因素影响，众多研究表明，同一种藻类对不同重金属表现出不同的耐受性，同种重金属对不同藻类亦存在不同的作用效果[9]。主要是由于藻类对金属的亲和力不同差异造成了金属离子对藻类的抑制作用大小，藻类对金属的亲和力不止表现在富集效率上，同时也体现在对不同离子的选择性上，即与水合离子的半径、静电引力有关[26]。通过相关研究可以推论波吉卵囊藻对锌和六价铬的水合半径相近，静电大小相似。重金属对波吉卵囊藻的研究目前国内还停留在对重金属铜、锌的等个别金属的研究，对于波吉卵囊藻更全面的开发和利用，需要对其重金属影响方面做更加深入和全面的实验研究。

4 结论

重金属铬对波吉卵囊藻的生长具有低促高抑作用，低浓度下促进藻细胞和叶绿素含量的增多，同时促进藻蛋白的增加。但高浓度下的铬离子会不同程度抑制波吉卵囊藻的生长。

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AnalysisofheavymetalchromiumtoleranceofOocystisborgei

DONG Long-xiang,CHENG Jun-ming,HU Kun,YANG Xian-le

(StateCollectionCenterofAquaticPathogen,ShanghaiOceanUniversity,Shanghai201306,China)

2017-03-28；

2017-05-18

公益性农业行业专项(201203085)；国家水产种质资源平台项目

董龙香(1990- )，女，硕士研究生，专业方向为水产微生态制剂研发。E-mail：lxdong0718@163.com

杨先乐。E-mail：xlyang@shou.edu.cn

S946.3

A

1000-6907-(2017)05-0072-07