肿瘤坏死因子α对肠上皮细胞株HT-29的核转录因子κB信号通路的激活作用研究

姚 晖，王明明，陈旺盛，任 磊，徐 亮

（西南医科大学附属医院 胃肠外科，四川泸州 646000）

肿瘤坏死因子α对肠上皮细胞株HT-29的核转录因子κB信号通路的激活作用研究

姚 晖，王明明，陈旺盛，任 磊，徐 亮★

（西南医科大学附属医院 胃肠外科，四川泸州 646000）

目的：研究肿瘤坏死因子α（TNF-α）对肠上皮细胞株HT-29的核转录因子κB（NF-κB）信号通路的激活作用及鼠尾草酚对TNF-α诱导HT-29的NF-κB激活的影响。方法：将HT-29细胞分为空白对照组、TNF-α组和低、中、高剂量鼠尾草酚组。用CCK-8法检测HT-29细胞活力；Western-blot方法检测IκBα、Pi-IκBα和Pi-IKKα/β蛋白表达；用NF-κB转录活性试剂盒检测HT-29细胞NF-κB转录活性。结果：实验各组的HT-29细胞活力比较无显著性差异 （P＞0.05）；TNF-α刺激可诱导HT-29的IκBα磷酸化及降解；鼠尾草酚能使TNF-α诱导 HT-29 的 IKKα/β 和 IκBα 磷酸化显著受抑制（均 P＜0.05），并且可显著降低 NF-κB 的转录活性（P＜0.05）。结论：TNF-α可激活HT-29的NF-κB经典信号通路，鼠尾草酚对TNF-α诱导的NF-κB激活有抑制作用。

鼠尾草酚；肿瘤坏死因子-α；核转录因子-κB；炎症性肠病

肠上皮细胞是机体的第一道防线，行使固有免疫的许多功能[1]。肠黏膜长时间过度激活，并产生过多促炎因子是肠道炎症的重要病理改变[2]。克罗恩病（CD）患者[3]和溃疡性结肠炎（UC）患者[4]结肠内发现有高水平的肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）表达，这提示 TNF-α 在炎症性肠病 （inflammatory bowel disease，IBD）的发病中起重要作用。TNF-α信号通路会导致一系列基因转录，核转录因子（nuclear factor-κB，NF-κB）的激活是介导这一过程的关键因素[5]。NF-κB激活后会导致下游相关炎症基因如细胞因子、趋化因子等转录。鼠尾草酚（carnosol）是一种源自植物迷迭香提取物的多酚类单体，许多研究表明它具有抗炎、抗氧化和抗增殖作用[6～9]。本研究拟探讨TNF-α对肠上皮细胞株HT-29的NF-κB经典信号通路的激活作用及鼠尾草酚对NF-κB激活的影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及材料

Carnosol（美国 Caymen公司），DMEM 培养基、胎牛血清（Gbico公司，美国），人重组TNF-α（美国Invitrogen公司），CCK-8检测试剂盒（上海同仁化学研究所），TransAMTM NF-κB试剂盒（美国 Active Motif公司），兔抗人 Phospho-IKKα/β 多克隆抗体、小鼠抗人IκBα单克隆抗体、小鼠抗人Phospho-IκBα 单克隆抗体（美国 Cell signaling公司），小鼠抗人GAPDH单克隆抗体 （美国Santa cruz生物公司），羊抗小鼠二抗IgG-HRP、羊抗兔二抗IgG-HRP（北京博奥森生物技术有限公司），全蛋白提取试剂盒 （南京凯基生物科技发展有限公司），PVDF膜（美国 Milipore公司）。

1.2 主要仪器

超净工作台 （美国Thermo Forma公司），CO2恒温细胞培养箱（美国Thermo Forma公司），恒温孵箱（日本Sanyo公司），全自动酶标仪Multiskan MK3（芬兰 Thermo公司）。

1.3 细胞培养

肠上皮细胞株HT-29购自中科院上海细胞库。用含10%FBS的DMEM培养液 （含青霉素100U/ml，链霉素 100U/ml），置于 37℃、5%CO2饱和湿度培养箱培养，2～3d更换培养液。

1.4 实验分组

HT-29细胞培养48 h，生长至90%密度，再同步化培养12h。将实验细胞分为：空白对照组、TNF-α 组（10ng/ml TNF-α）和低、中、高剂量鼠尾草酚组（10ng/ml TNF-α＋10、20、40μmol/L 鼠尾草酚）。鼠尾草酚组用不同剂量鼠尾草酚预处理18h，再加入TNF-α刺激6h，然后进行指标检测。

1.5 CCK-8法检测HT-29细胞活力

细胞接种于96孔板培养48h，生长至80%密度。换成无血清培养基，同步化培养12h。加入药物分组再培养24h，每组设3个复孔。每孔加入10μl的CCK-8，培养2h。用酶标仪测定450nm吸光度（OD 值）。

1.6 Western-blot法检测 HT-29 细胞 IκBα、Pi-IκBα、Pi-IKKα/β 和 GAPDH 的表达

提取HT-29细胞总蛋白，经10%SDS-PAGE电泳后转PVDF膜，将PVDF膜用含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液中摇床37℃封闭1h。PVDF膜浸泡于稀释好的第一抗体，室温下摇床孵育1h。漂洗后的PVDF膜再浸泡于用辣根过氧化物酶标记的二抗，室温下摇床孵育1h。PVDF膜漂洗后用增强化学发光法（ECL）检测目的蛋白条带。

1.7 NF-kB转录活性试剂盒法检测HT-29细胞NF-κB的转录活性

制备HT-29细胞核提取物。试剂盒96孔板中每孔加入30μl完全结合缓冲液。空白对照孔加入20μl完全裂解缓冲液，样品孔每孔加入20μl（5μg）核提取物，浸泡于摇床轻摇1h。每孔用缓冲液洗3次后加入NF-κB抗体，室温下静置1h。缓冲液洗3次后，加入二抗，室温下静置1h。每孔加入100μl显色液，室温下避光孵育5min。用酶标仪在450nm波长下测出每孔的OD值。

1.8 统计学方法

应用SPSS18.0统计学软件进行数据分析，多样本均数的比较采用单因素方差分析，两样本间的比较采用配对t检验。

2 结果

2.1 实验各组HT-29细胞活力的比较

图1 鼠尾草酚和TNF-α对HT-29活力的影响

图2 TNF-α对HT-29细胞IκBα磷酸化及降解的影响

图3 鼠尾草酚对TNF-α诱导下HT-29的Pi-IKKα/β和Pi-IκBα蛋白表达的影响

结果如图1显示，在试验浓度下，TNF-α和鼠尾草酚对HT-29细胞活力无显著影响（各组间比较 P＞0.05）。

2.2 TNF-α对HT-29细胞 IκBα磷酸化及降解的影响

如图2所示，TNF-α刺激可诱导 IκBα磷酸化，pi-IκBα蛋白表达在5min就达到高峰，随着时间推移，30min降到最低水平，60min后再次出现高峰，一直维持到12h。TNF-α刺激后，IκBα开始泛素化降解，30min达到最低谷，60min后IκBα蛋白表达水平恢复到刺激前水平。

2.3 鼠尾草酚对TNF-α诱导HT-29细胞Pi-IKKα/β 和 Pi-IκBα 的表达的影响

结果如图3所示，与空白对照组比较，TNF-α刺激组 Pi-IKKα/β 和 Pi-IκBα 表达显著增加（P＜0.05）。与TNF-α刺激组比较，低、中、高剂量鼠尾草酚组的Pi-IKKα/β和Pi-IκBα表达显著受到抑制（P＜0.05）。

2.4 鼠尾草酚对HT-29细胞NF-κB的转录活性的影响

如图4所示，与空白对照组比较，TNF-α刺激组的NF-κB亚基p65和p50同DNA的结合活性显著增强（P＜0.05）。与 TNF-α 刺激组比较，低、中、高剂量鼠尾草酚组的p65和p50亚基同DNA的结合活性显著受到抑制（P＜0.05）。

3 讨论

在肠道慢性炎症状态下，多种促炎因子表达增加。TNF-α主要由单核细胞巨噬细胞分泌，导致肠道多种细胞包括肠上皮细胞处于炎症激活状态[10]。分化的肠上皮细胞株HT-29表现出成熟肠上皮细胞的特性，故很多药物研究把HT-29细胞作为研究肠黏膜疾病的模型[11]。本研究发现，人重组TNF-α可诱导HT-29细胞IκBα磷酸化及降解，由于IκBα磷酸化激活是NF-κB通路的关键步骤，故我们的试验结果提示TNF-α诱导下的HT-29细胞可以作为研究炎症性肠病（IBD）的肠上皮细胞模型。

鼠尾草酚是迷迭香的提取物的主要成份之一，属于二萜酚类化合物。最近研究发现[12]，鼠尾草酚能抑制TNF-α诱导下脐静脉内皮细胞的细胞粘附分子ICAM-1和VCAM-1的表达。但其对肠上皮细胞的抗炎机制尚未完全阐明，为此我们进一步研究了鼠尾草酚对TNF-α诱导下NF-κB信号通路激活产生的影响。在促炎因子TNF-α、IL-1等刺激下，肠上皮细胞NF-κB会大量激活，引发下游大量炎症相关因子转录。通过结合TNFR1和 （或）TNFR2，TNF-α通过TNFR相关因子2（TRAF2）和Ser/Thr激酶受体相互作用蛋白传递信号，导致 IκB 激酶（IKK）磷酸化激活[13]。 IKKα/β的激活，接着又会导致IκB-α的磷酸化激活[14]。磷酸化的IκBα降解后释放激活NF-κB二聚体，后者入核导致下游基因的转录。以上就是TNF-α激活的NF-κB经典信号通路。我们的实验发现，鼠尾草酚可以导致TNF-α诱导的HT-29细胞NF-κB经典信号通路的激活被抑制。但鼠尾草酚具体作用于NF-κB信号通路哪个位点，是直接作用还是间接作用，以及是否会抑制肠上皮细胞下游炎症相关基因的激活，尚有待于进一步研究。

鼠尾草酚属于多酚类物质，至今已发现的植物多酚已有8000多种，组成人们食物中规模最大次级代谢产物群。细胞和动物研究发现，许多植物多酚具有抗肠道炎症作用，其中姜黄（curcumin）是首个用于IBD临床研究的植物多酚类药物[15]。鼠尾草酚与姜黄同为植物多酚，其抑制内皮细胞细胞粘附分子表达，以及抑制肠上皮细胞NF-κB通路激活的药理作用，使其有望用于IBD缓解诱导后长期的维持治疗。

[1]Silva FA，Rodrigues BL，Ayrizono ML，et al.The immunological basis of inflammatory bowel disease[J].Gastroenterol Res Pract，2016，2016：2097274.Epub 2016 Dec 14.

[2]Sartor RB.Pathogenesis and immune mechanisms of chronic inflammatory bowel disease[J].Am J Gastroenterol，1997，92：58-118.

[3]Boirivant M，Marini M，Di Felice G，et al.Lamina propria T cells in Crohn's disease and other gastrointestinal inflammation show defective CD2 pathway-induced apoptosis[J].Gastroenterology，1999，116：557-565.

[4]Schreiber S.Monocytes or T cells in Crohn’s disease：does IL-16 allow both to play at that game?[J].Gut，2001，49：746-749.

[5]Slevin SM，Egan LJ.New insights into the mechanisms of action of anti-tumor necrosis factor-α monoclonal antibodies in inflammatory bowel disease[J].Inflamm Bowel Dis，2015，21（12）：2909-2920.

[6]Chang CH，Chyau CC，Hsieh CL，et al.Relevance of phenolic diterpene constituents to antioxidant activity of supercritical CO（2） extract from the leaves of rosemary[J].Nat Prod Res，2008，22（1）：76-90.

[7]Rau O，Wurglics M，Paulke A，etal.Carnosic acid and carnosol，phenolic diterpene compounds of the labiate herbs rosemary and sage，are activators of the human peroxisome proliferator-activated receptor gamma[J].Planta Med，2006，72（10）：881-887.

[8]Schwager J，Richard N，Fowler A，et al.Carnosol and related substances modulate chemokine and cytokine production in macrophagesand chondrocytes[J].Molecules，2016，21 （4）：465-478.

[9]Vergara D，Simeone P，Bettini S，et al.Antitumor activity of the dietary diterpene carnosol against a panel of human cancer cell lines[J].Food Funct，2014，5（6）：1261-1269.

[10]Walczak H.TNF and ubiquitin at the crossroads of gene activation，celldeath，inflammation，and cancer[J].Immunol Rev，2011，244（1）：19-28.

[11]Shapiro H，Singer P，Halpern Z，et al.Polyphenols in the treatment of inflammatory bowel disease and acute pancreatitis[J].Gut，2007，56：426-435.

[12]Yao H，Chen Y，Zhang L，et al.Carnosol inhibits cell adhesion molecules and chemokine expression by tumor necrosis factor-α in human umbilical vein endothelial cells through the nuclear factor-κB and mitogen-activated protein kinase pathway[J].Mol Med Rep，2014，9（2）：476-480.

[13]Aggarwal BB.Signalling pathways of the TNF superfamily：a double-edged sword[J].Nat Rev Immunol，2003，3：745-756.

[14]Billmeier U，Dieterich W，Neurath MF，et al.Molecular mechanism of action of anti-tumor necrosis factor antibodies in inflammatory bowel diseases[J].World J Gastroenterol，2016，22（42）：9300-9313.

[15]Romier B，Schneider YJ，Larondelle Y，et al.Dietary polyphenols can modulate the intestinal inflammatory response[J].Nutr Rev，2009，67：363-378.

Study of tumor necrosis factor-α on activation of the nuclear factor-κB pathway in intestinal epithelial cell line HT-29

YAO Hui，WANG Ming-ming，CHEN Wang-sheng，et al//Journal of China-Japan Friendship Hospital，2017 Aug，31（4）：222-225

Objective：To study the effect of tumor necrosis factor（TNF）-α on activation of nuclear factor（NF）-κB pathway in intestinal epithelial cell line HT-29 as well as effect of carnosol on NF-κB pathway in TNF-α-stimulated HT-29.Methods：HT-29 cells were divided into five groups：control group，TNF-α group，and low- ，mid- ，high-dose carnosol groups.Cell counting kit-8 （CCK-8）was used for analysis of HT-29 viability.Expression of IκBα、Pi-IκBα and Pi-IKKα/β in HT-29 were evaluated by Western-blot.NF-κB-DNA binding activation of HT-29 was analyzed with the TransAM NF-κB Family Kit.Results：There were no significant differences on cell viability in five groups （P＞0.05）.TNF-α could induce IκBα phosphorylation and degradation in HT-29.Carnosol significantly inhibited IKKα/β and IκBα phosphorylation and NF-κB-DNA binding activation in TNF-α-stimulated HT-29 （P＜0.05）.Conclusion：TNF-α induces activation of NF-κB classic pathway in HT-29 and carnosol inhibits TNF-α-induced activation of NF-κB in HT-29.Carnosol can be used in inflammatory bowel disease （IBD）due to its anti-inflammatory properties targeting intestinal epithelial cells.

carnosol；tumor necrosis factor-α；nuclear factor-κB；inflammatory bowel disease

R286

A

1001-0025（2017）04-0222-04

10.3969/j.issn.1001-0025.2017.04.006

Author’s addressDepartment of Gastrointestinal Surgery，The Affiliated Hospital of Southwest Medical University， Luzhou 646000，Sichuan Province，China

西南医科大学附属医院博士人才基金资助项目（201143）

* 本文通讯作者。

姚 晖（1974-），男，主治医师，医学博士。

2016-09-24

2017-01-26