基于抗原决定基的胰岛素分子印迹电化学传感器

赵成军+马雄辉+李建平

摘要采用抗原决定基法制备了胰岛素电化学分子印迹传感器。以胰岛素C端多肽作为模板分子，定向自组装在Au电极上，以邻苯二胺为功能单体，电化学聚合制备分子印迹聚合膜。以NaOH为洗脱液，洗脱模板分子，形成的与胰岛素C端多肽三维结构相匹配的分子印迹孔穴能特异性识别胰岛素。重吸附胰岛素分子后，以K3[Fe（CN）6]/K4[Fe（CN）6]为探针，通过测量探针在电极表面产生的电流大小实现胰岛素的间接测定。在1.0 × 10

Symbolm@@ 14～5.0 × 10

Symbolm@@ 13 mol/L浓度范围内，传感器的电流响应值与胰岛素浓度呈良好的线性关系，检出限为7.24 × 10

Symbolm@@ 15 mol/L（3σ）。此传感器具有较好的选择性和稳定性，并成功用于血清样品中胰岛素的测定。

关键词胰岛素； 分子印迹； 电化学传感器； 抗原决定基法

1引 言

胰岛素是一种对体内碳水化合物和脂肪代谢调节至关重要的激素[1]，对促进人体合成糖原、脂肪和蛋白质，以及人体细胞的生长发育和人体健康具有重要的意义。目前， 检测胰岛素的方法主要有酶联免疫分析法[2]、发光免疫分析法[3]、放射免疫分析法[4]和高效液相色谱法[5，6]等。这些方法存在易受干扰、测试条件苛刻、仪器昂贵等缺点。因此，建立特异性识别胰岛素的简便、快速的分析方法具有重要意义。

分子印迹传感器因其具有良好的特异性识别能力和操作简单等优点而迅速发展[7]，并在蛋白质等大分子检测领域中得到广泛的运用[8～10]。Prasad等[11]以胰岛素为模板分子，以磷脂酰胆碱脂作为功能单体通过自由基聚合在多壁碳纳米管表面制备分子印迹聚合物（MIP）修饰电极，利用胰岛素含有的酪氨酸残基在0.8V产生不可逆氧化峰对胰岛素进行测定。由于胰岛素的构象多样性，空间位阻效应大，导致该法模板分子不易洗脱；胰岛素电活性差，直接测量氧化电流灵敏度较低，且氧化电位过高，样品中共存还原性物质易产生干扰。

抗原决定基法[12～14]是近年发展起来的一种蛋白质印迹新方法，该法以蛋白质表面的特征多肽作为模板分子制备分子印迹聚合物，以形成的三维孔穴特异地识别多肽，进而对蛋白质分子进行识别[15，16]，避免了整体印迹法模板分子不易洗脱等缺点。但用抗原决定基法构建胰岛素分子印迹传感器尚未见报导。本研究将半胱氨酸修饰的胰岛素C端多肽定向自组装在Au电极表面，作为模板分子，以邻苯二胺（oPD）作为功能单体，采用电化学聚合的方法制得胰岛素C端多肽分子印迹膜；洗脱后的分子印迹膜上形成能特异性识别该段多肽的孔穴，进而识别整个胰岛素分子。通过测量K3[Fe（CN）6]/K4[Fe（CN）6]探针在电极上产生的氧化还原电流，实现胰岛素含量的间接测定。

2实验部分

2.1仪器与试剂

CHI660D电化学工作站（上海辰华仪器有限公司）；AL204型电子分析天平（梅特勒托利多仪器有限公司）；KQ3200DE数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）； PHS3D数显酸度计（上海雷磁仪器厂）；采用三电极系统：工作电极为Au电极（d=2.0 mm），Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为对电极。

邻苯二胺、甲醇（中国国药集团化学试剂有限公司）；K3Fe（CN）6、K4Fe（CN）6、Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O等试剂（西陇化工股份有限公司）；半胱氨酸修饰的胰岛素C端多肽（CysAlaLysProThrTyrPheGly，上海杰肽生物科技有限公司）；胰岛素（大连美仑生物技术有限公司）。若无特殊说明，实验所用试剂均为分析纯，实验用水均为二次蒸馏水。

胰岛素C端多肽溶液的配制：以0.02 mol/L PBS緩冲溶液（pH 7.4）配制1.0 × 10

Symbolm@@ 4 mol/L胰岛素C端多肽溶液，4℃保存，待用。邻苯二胺溶液的配制： 以0.02 mol/L PBS溶液（pH 7.4）配制5 mmol/L邻苯二胺溶液。

2.2实验方法

2.2.1自组装胰岛素C端多肽移取适量胰岛素C端

多肽溶液于0.5 mL离心管中，将抛光后的Au电极浸入胰岛素C端多肽溶液中1 h，利用AuS键进行自组装，以K3[Fe（CN）6]/K4[Fe（CN）6]溶液为探针，通过差分脉冲伏安法（DPV）、循环伏安法（CV）和交流阻抗法（EIS）对自组装后的修饰电极进行表征。

2.2.2传感器的制备将配制好的邻苯二胺溶液转移至15 mL烧杯中，

以自组装胰岛素C端多肽后的Au电极为工作电极， 通过循环伏安法（CV）进行电聚合，电位为0～0.8 V，扫描速度为50 mV/s，扫描圈数为10 圈，形成分子印迹聚合物（Molecularly imprinted polymer， MIP）。以2 mol/L NaOH溶液为洗脱液，将聚膜后的修饰电极在磁力搅拌下进行洗脱，洗脱时间为35 min，将模板分子洗脱后，得到分子印迹传感器。非分子印迹聚合膜（Nonmolecularly imprinted polymer， NMIP）的制备不需要在Au电极上自组装胰岛素C端多肽，其它步骤与分子印迹膜制备相同。制备过程如图1所示。

3结果与讨论

3.1分子印迹膜的制备

以0.02 mol/L PBS （pH = 7.4）缓冲溶液为溶剂，配制5 mmol/L邻苯二胺溶液，以循环伏安法进行电聚合，聚合电位为0～+0.8 V，扫描速度为50 mV/s。结果如图2所示，随着扫描圈数的增加，电流逐渐减小并趋于稳定，说明邻苯二胺已成功聚合在Au电极上[17]。此外，胰岛素C端多肽在该电位范围内仅有极弱的特征峰，因此，可忽略在分子印迹膜电聚合过程中胰岛素C端多肽的电极反应。endprint

3.2印跡过程的表征

3.2.1循环伏安表征按照2.2.2节的方法，分别制备分子印迹传感器和非分子印迹传感器，并对2.5 × 10

3.2.2交流阻抗法表征EIS通过测量电极表面阻抗的变化，间接对分子印迹传感器进行表征。如图4所示，裸电极时，电极表面与溶液中电活性物质直接接触，因此阻抗很小（图4a）。随着印迹膜在Au电极上聚合，膜的致密性导致电极表面的阻抗变得很大（图4b）；而当洗脱分子印迹膜中模板分子后，形成的印迹孔穴作为电子传递的通道，因此电极表面阻抗变小（图4c）；重吸附后，胰岛素C端多肽和胰岛素填充于印迹孔穴中，阻碍了探针离子穿过孔穴到达电极表面，交流阻抗又重新变大（图4d， 4e）。 而NMIP中没有形成印迹膜，洗脱后（图4f）无法形成印迹孔穴，探针分子无法到达电极表面，因此交流阻抗基本不发生变化（图4g）。

3.3自组装时间及胰岛素C端多肽用量优化

用不同浓度胰岛素C端多肽进行自组装1 h，制备MIP电极，洗脱后对3.0 × 10

3.4洗脱液的选择和洗脱时间的优化

分别以硫酸、甲醇、甲醇乙酸、氢氧化钠等作为洗脱液在搅拌下对胰岛素C端多肽进行洗脱，结果表明，用硫酸、甲醇、甲醇乙酸（8∶1， V/V）分别进行洗脱后电流基本没有变化，说明上述溶液不能将胰岛素C端多肽洗脱掉；以2 mol/L NaOH作为洗脱液进行洗脱，随着洗脱时间延长，探针电流逐渐增大，将洗脱后的修饰电极对不同浓度的胰岛素溶液进行重吸附，取得良好结果，说明NaOH可将模板分子洗脱，因此选择2 mol/L NaOH作为本实验洗脱液。对洗脱时间进行了优化，结果表明，当洗脱时间达到35 min后，探针电流趋于平稳，说明洗脱已达到平衡。后续实验中洗脱时间为35 min。

3.5重吸附介质pH和重吸附时间的优化

重吸附时间是MIP电极对目标分子进行特异性识别所需的时间。将洗脱后的MIP电极在胰岛素C端多肽（图6A，曲线a）和胰岛素溶液（图6A，曲线b）中分别进行重吸附，记录不同时间后的DPV峰电流。如图6A所示，随着重吸附时间延长，胰岛素逐渐特异性地结合在印迹孔穴中，阻碍了探针在电极上的扩散，导致峰电流逐渐减少，当重吸附时间达到9 min后两种电极的电流基本不再变化，说明印迹膜对胰岛素C端多肽和胰岛素的重吸附过程已达到平衡，因此在后续实验中选择重吸附时间为9 min。

以0.02 mol/L PBS缓冲溶液作为重吸附介质，配制了不同pH值的胰岛素溶液，将经洗脱后的MIP电极分别在上述溶液中搅拌重吸附9 min，测量探针分子DPV峰电流。如图6B所示，当胰岛素溶液pH=7.4时电流最小，说明传感器在pH=7.4时对胰岛素的识别效果最佳。

3.8重现性与稳定性

利用同一支传感器对2.5 × 10

Symbolm@@ 13 mol/L的胰岛素进行6次重复测定，其测定结果的相对标准偏差为1.13%；利用同一方法制备6支分子印迹传感器，在同样的实验条件下，对2.5 × 10

Symbolm@@ 13 mol/L的胰岛素进行测定，测定结果的相对标准偏差为1.4%。实验结果表明传感器具有良好的重现性。此外对传感器的稳定性也进行了考察，将制备好的传感器于4℃下保存在PBS（pH=7.4）中。3天后3组传感器电流响应值平均下降了2.87%，2周后电流平均下降小于5.0%，说明传感器具有良好的稳定性。

3.9实际样品分析

利用加标回収法对桂林理工大学校医院血清样（稀释100倍）进行检测，结果如表2所示，回收率为94.5%～104.1%， 表明此传感器可用于实际血清样中胰岛素的检测。

4结 论

首次利用抗原决定基法制作了胰岛素分子印迹传感器，以[Fe（CN）6]3

Symbolm@@ /4

Symbolm@@ 作为探针， 间接地对胰岛素进行测量。以胰岛素C端多肽作为模板分子，有效地降低了识别过程中空间位阻效应，简化了洗脱步骤；通过测量探针在印迹电极上产生的氧化还原电流进行定量分析，使检测灵敏度显著提高。此传感器具有选择性好、检出限低、重现性好和操作简单等特点，可对痕量胰岛素进行检测。

References

1Pu Y， Zhu Z， Han D， Liu H， Liu J， Liao J， Zhang K， Tan W. Analyst， 2011， 136（20）： 4138-4140

2Andersen L， Dinesen B， Jorgensen P N， Poulsen F， Roder M E. Clin. Chem.， 1993， 39： 578-582

3Forest J C， Masse J， Lane A. Clin. Biochem.， 1998， 31（2）： 81-88

4Zhang X， Zhu S， Deng C， Zhang X. Chem. Commun.， 2012， 48： 2689-2691

5Moein M M， Javanbakh M， Akbariadergani B. Talanta， 2014， 121： 30-36

6Ho E N M， Wan T S M， Wong A S Y， Lam K K H，Stewart B D. J. Chromatogr. A， 2008， 1201（2）： 183-190

7Li J P， Jiang F Y， Wei X P. Anal. Chem.， 2010， 82（14）： 6074-6078

8Zhou J， Gan N， Hu F， Li T， Zhou H， Li X， Zheng L. Sens. Actuators B， 2013， 186： 300-307endprint

9CHEN ZhiQiang， LI JianPing， ZHANG XueHong， JIANG FuYang. Journal of Instrumental Analysis， 2010， 29（1）： 97-104

陳志强， 李建平， 张学洪， 蒋复阳. 分析测试学报， 2010， 29（1）： 97-104

10WANG Ying， HUANG ChunFang， LIANG RuPing， QIU JianDing. Chinese J. Anal. Chem.， 2013， 41（5）： 787-794

王 莹， 黄春芳， 梁汝萍， 邱建丁. 分析化学， 2013， 41（5）： 787-794

11Prasad B， Madhuri R， Tiwari M， Sharma P. Electrochim. Acta， 2010， 55： 9146-9156

12Li S， Cao S， Whitcombe M， Piletsky S. Prog. Polym. Sci.， 2014， 39： 145-163

13Yang K， Li S， Liu J， Liu L， Zhang L， Zhang Y. Anal. Chem.， 2016， 88（11）： 5621-5625

14Qin Y， Li D， He X， Li W， Zhang Y. ACS Appl. Mater. Interfaces， 2016， 8： 10155-10163

15MA XiongHui， LI JianPing， WANG Chao， XU GuoBao. Chinese J. Anal. Chem.， 2016， 44（1）： 152-159

马雄辉， 李建平， 王 超， 徐国宝. 分析化学， 2016， 44（1）： 152-159

16Uzun L， Turner A. Biosens. Bioelectron.， 2016， 76： 131-144

17Yang B， Li J， Zhang L， Xu G. Analyst， 2016， 141： 5822-5828

18Li J P， Zhao J， Wei X P. Sens. Actuators B， 2009， 140： 663-669

19Yilmaz B， Kadioglu Y， Capoglu I. J. Chromatogr. Sci.， 2012， 50： 586-590

20Frasconi M， Tortolini C， Botre F， Mazzei F. Anal. Chem.， 2010， 82（17）： 7335-7342

21Liang K， Wu H， Li Y. Clin. Proteomics， 2017， 14： 5-13

22Poulsen F， Jensen K. J. Biomol. Screen， 2007， 12： 240-247

23Even M， Sandusky C， Barnard N， Mistry J， Sinha M. Clin. Biochem.， 2007， 40： 98-103

An Insulin Molecularly Imprinted Electrochemical

Sensor Based on Epitope Imprinting

ZHAO ChengJun， MA XiongHui， Li JianPing*

（Guangxi Key Laboratory of Electrochemical and Magnetochemical Function Materials，

Guangxi Colleges and Universities Key Laboratory of Food Safety and Detection，

College of Chemistry and Bioengineering， Guilin University of Technology， Guilin 541004， China）

AbstractA novel molecularly imprinted electrochemical sensor for direct detection of insulin was prepared based on epitope imprinting. CTerminal polypeptide in insulin as template molecule was firstly selfassembled on the Au electrode. Then the molecularly imprinted polymer （MIP） was fabricated by electropolymerization with ophenylenediamine （oPD） as functional monomer on this Au electrode. After elution of template molecules by NaOH solution， the imprinting cavities were formed with the threedimensional structure matched with the polypeptide in insulin molecules. The imprinting cavities could specifically recognize and rebind with insulin molecules. With K3[Fe（CN）6]/K4[Fe（CN）6] as a probe， the insulin was indirectly detected. There was a linear relationship between the response current and the insulin concentrations in the range of 1.0 × 10

Symbolm@@ 14-5.0 × 10

Symbolm@@ 13 mol/L， and the detection limit was 7.24×10

Symbolm@@ 15 mol/L. The developed sensor exhibited good selectivity and stability， and could be applied to the determination of serum samples.

KeywordsInsulin； Molecular imprinting； Electrochemical sensor； Epitope imprinting

（Received 23 April 2017； accepted 6 July 2017）

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （Nos. 21375031， 21765006） and the Natural Science Foundation of Guangxi Province， China （No. 2015GXNSFFA139005）.endprint